"Narra una leggenda che quando il gioco degli scacchi fu prescritato
per la prima volta a corte il sultano volle premiare l'oscuro inventore
esaudendo ogni suo desiderio. Questi chiesQper sé un compenso apparentemente
modesto di avere cioè tanto grano quanto poteva risultare da una
semplice addizione: un chicco sulla prima delle sessantaquattro caselle,
due chicchi sulla seconda, quattro sulla terza e così via...
Ma quando il sultano, che aveva in un primo tempo accettato di buon grado,
si rese conto che a soddisfare una simile richiesta non sarebbero bastati
i granai del suo regno, e forse neppure quelli di tutta la terra, per togliersi
dall'imbarazzo stimò opportuno mozzargli la testa".
| · Stampo di DNA a singolo filamento |
| · Primers (oligonucleotidi complementari a sequenze specifiche del DNA bersaglio) |
| · Desossinucleotidi trifosfato (dNTP) |
| · DNA polimerasi |
| · Tampone di reazione coli tenente Mg2+ |
| Ripetizione di cicli costituiti da tre fasi: |
| I. Denaturazionedel DNA a doppio filamento a 92-96°C |
| 2. Appaiamento (annealing) dei primers alle sequenze complementari dello stampo a 45-72°C |
| 3. Allungamento dei primers alle loro estremità 3' -OH per aggitinta di dNTP a 72°C |
| Un iniziale riscaldamento della miscela di reaziolie a 95°C per 3-5 minuti è sufficiente per denaturare completamente un DNA genomico. |
Questa è una fase cruciale per l'ottimizzazione della specificità di una PCR. Nei primi cicli di reazione i primers devono "cercare" le loro sequenze complementari sul DNA stampo. La probabilità e la specificità di annealing dipendono principalmente dalla temperatura dal tempo e dal prodotto delle concentrazioni della sequenza bersaglio e dei primers. Nei primi cicli, però, la probabilità di un annealing corretto dipende essenzialmente dalla concentrazione del DNA bersaglio, in quanto questa è inizialmente piuttosto bassa e raddoppia ad ogni ciclo, mentre la diminuzione della concentrazione dei primers è trascurabile.Il tempo necessano ai primers per "trovare" il loro bersaglio è anch'esso estremamente importante. Se la temperatura è troppo alta, l'annealing non può avvenire se è troppo bassa possono verificarsi degli appaiamenti aspecifici. Comunque la temperatura di annealing ottimale va determinata per via sperimentale. |
| Viene di solito condotta a 72°C per un tempo che dipende dalle dimensioni del prodotto di amplificazione. |
Viene condotta a 95°C per un tempo che dipende dal tipo di amplificatore e dallo spessore delle provette di reazione. E' consigliabile non terminare un saggio di PCR con una fase di denaturazione, in quanto il rapido raffreddamento che ne consegue potrebbe dar luogo a strutture secondarie dei frammenti di DNA a singolo filamento, anziché appaiamento dei frammenti complementari. |
| Non dovrebbe superare il valore di 40, in quanto un numero di cicli troppo elevato porta spesso alla formazione di prodotti di amplificazione non desiderati. Ciò sembra essere dovuto a una diminuzione della stringenza delle condizioni di reazione e al raggiungimento di concentrazioni limitanti di uno o più componenti di reazione. |
| Di solito. dopo l'ultimo ciclo di amplificazione, si conduce una fase a 72°C per 5-15 minuti, con lo scopo di completare la sintesi di prodotti di allungamento parziale e di consentire 1 'appaiamento dei prodotti di DNA a singolo filamento complementari. Le miscele di reazione possono quindi essere conservate a -2O°C prima di essere analizzate. |
| Materiale e strumentazione impiegati (es. tipo di provette e amplificatore) |
| Temperatura e durata di ciascuna fase di reazione e numero di cicli |
| Tipo di DNA polimerasi e sua concentrazione |
| Composizione del tampone di reazione (particolarmente concentrazione di Mg2+ ) |
| Concentrazione dei dNTP |
| Primers |
| Volume di reazione |
| Quantità e purezza dello stampo di DNA |
| Struttura e dimensioni del prodotto di amplificazione |