LO SCREENING NEONATALE IN TOSCANA
T.Repetto

Perché

Le ragioni di un programma per lo screening neonatale per la fibrosi cistica (FC) sono  basate sulla possibilità di identificare precocemente questa malattia con il vantaggio di avviare un programma di cura prima che si manifestino sintomi evidenti o complicanze irreversibili.
Numerosi studi dimostrano che il decorso clinico della malattia è complessivamente migliore nei pazienti diagnosticati per screening alla nascita rispetto a quelli diagnosticati più tardivamente per sintomi.
In particolare lo stato nutrizionale  e la crescita sono avvantaggiati nei primi anni di vita  e il trattamento mirato delle infezioni respiratorie condiziona  una  prognosi migliore.
Un ulteriore vantaggio dello screening neonatale è dato dalla possibilità di poter fornire  precocemente alla coppia di un bambino affetto e ai familiari un'adeguata consulenza genetica, essendo oggi disponibile la diagnosi pre-natale per FC.

Dove e quando
Lo screening neonatale in Toscana è iniziato nel 1982, la metodica è stata modificata man mano che si standardizzavano tecniche più accurate, di miglior sensibilità e specificità
La Toscana è stata una delle prime regioni in Italia ad attuare un programma di  screening per FC: eseguito in solo 4 regioni  a metà degli anni 90 e in 8 nel 2000. A  seguito di una legge nazionale tale pratica si sta estendendo al resto delle regioni italiane.

I numeri
L'attuale metodica del dosaggio dell'immunotripsina su goccia di sangue accoppiata alla determinazione della lattasi su meconio è stata adottata da questo Centro nel 1991 .
Negli ultimi 10 anni sono stati sottoposti a screening 261.159 neonati.
Grazie ad una buona collaborazione fra i punti nascita, le ostetriche e il Centro Regionale di Riferimento, stimiamo che praticamente la totalità dei nati in Toscana venga sottoposto a screening.
Sui 261.159 neonati esaminati nell'ultimo decennio, sono stati diagnosticati per screening 54  pazienti: 3 bambini sono stati diagnosticati per sintomi (2 falsi negativi 1 sfuggito allo screening); se aggiungiamo a questi 7 diagnosi prenatali, abbiamo un totale di 64 diagnosi con un'incidenza della malattia in Toscana di 1 neonato affetto ogni 4081 da cui si deduce una frequenza del portatore è nella nostra regione di circa 1 persona ogni 32.
Conoscere questi dati è importante perché l'incidenza della malattia varia molto non solo fra popolazioni diverse, ma anche nella stessa popolazione a seconda delle aree geografiche mostrando nell'area mediterranea una grande eterogeneità. 
In Italia, per esempio, fra le regioni che praticano screening, il Veneto  ha un'incidenza di 1/2700 , la Lombardia di 1/4450, mentre la Campania, regione dove lo screening non viene fatto, di 1/7000.

Quale metodo
L'attuale metodo  prevede la determinazione quantitativa di tripsina immunoreattiva (IRT) su goccia di sangue prelevato in terza giornata di vita.
E' infatti ampiamente dimostrato che la tripsina ematica identificata con metodo immunologico è elevata nel neonato FC nelle prime settimane di vita
Questo è probabilmente dovuto all'ostruzione dei dotti pancreatici, condizione  presente in quasi tutti i neonati FC, indipendentemente dallo sviluppo successivo di insufficienza pancreatica.
Tale situazione, tuttavia,  si può  trovare in molte altre condizioni parafisiologiche del neonato, soprattutto nei prematuri, anche se generalmente in queste situazioni i valori tornano alla normalità in un tempo minore rispetto ai neonati  FC
Per ridurre il numero dei falsi positivi si è affiancato a questo un altro test che è la determinazione della lattasi nel meconio, una proteina di agevole determinazione che può risultare alta per ridotta funzionalità pancreatica.
I valori elevati di IRT e lattasi portano alla richiesta di una nuova determinazione IRT  (retesting) a un mese di vita, tempo in cui la maggior parte dei neonati senza FC hanno normalizzato i valori.
Solo chi sarà risultato ancora positivo verrà avviato al test del sudore, che è il solo test diagnostico per Fc, ma che non può essere eseguito prima che il bambino abbia 40 - 45 giorni di vita. Questo è il motivo per cui questo test che è il più sensibile e specifico per la diagnosi, non può essere usato come test di screening

Il problema del retesting
Il limite maggiore del test di screening è dovuto al numero molto  elevato dei falsi positivi al 1° dosaggio IRT  (circa 1/100 dei neonati screenati), che si cerca di ridurre accoppiando a questo il dosaggio della lattasi e, nei positivi, ripetendo il dosaggio IRT a un mese di vita (RETESTING). 
Fra i richiamati a retesting  1/2 risultano ancora positivi e quindi inviati al test del sudore.
A sua volta fra i bambini richiamati al test del sudore  risultano positivi e quindi affetti da FC 1/10 circa. Quindi un neonato richiamato al retesting ha circa 1 possibilità su 20 di essere affetto da FC.

Il  richiamo al retesting ha un suo pesante risvolto sul costo psicologico in termini di ansia e stato di allarme indotto nelle famiglie dei bambini richiamati.
Da qualche anno, per cercare di ridurre il numero dei falsi positivi, si è introdotto, accanto a quelli menzionati, un altro test che è la ricerca, delle  più frequenti mutazioni genetiche  FC.
Questo si ottiene estraendo il DNA dalla stessa goccia di sangue usata per  IRT ma trattandosi di un test genetico, è richiesto il  consenso della madre.

L'ileo da meconio e lo screening neonatale
L'ileo da meconio  è un'ostruzione intestinale a livello dell'ileo dovuta a meconio denso e vischioso. La causa più frequente è legata alla FC, anche se esistono altre  situazioni che sono associate a ileo meconiale e che non sono  associate a FC.
In neonati con FC l'ileo da meconio è presente nel 10 - 15% dei casi.
La patogenesi è legata all'insufficienza pancreatica esocrina e alla densità del muco intestinale i che comportano un ispessimento del meconio che già in utero può ostruire il lume intestinale: l'ileo terminale si dilata, il colon è piccolo e sottile ( microcolon).
La sintomatologia alla nascita è costituta da distensione addominale e vomito; la diagnosi è radiologica.
In alcuni casi si può presentare una ostruzione dovuta a tappo di meconio non a livello ileale, ma  a livello del colon distale, senza microcolon ( sindrome del tappo meconiale).
Il dosaggio del tripsinogeno immunoreattivo può risultare nella norma  nei neonati con fibrosi cistica e ileo da meconio
La presenza di ileo da meconio è pertanto indicazione assoluta all'esecuzione del
test del sudore, indipendentemente dai risultati dello screening neonatale.

ATTUALITÀ SUL PROGRAMMA DI SCREENING NEONATALE NELLA F.C.
G. Taccetti
Con il termine screening si definisce una strategia diagnostica che consente di identificare, in una popolazione di soggetti apparentemente sani, alcuni individui a rischio di essere affetti da una particolare malattia. Nel soggetto risultato positivo allo screening è giustificato il ricorso a  procedure diagnostiche aggiuntive. In sostanza, quindi, la procedura di screening non fornisce  una diagnosi definitiva di malattia  ma suggerisce e giustifica il ricorso a approfondimenti diagnostici per confermare o escludere la diagnosi.

La FC ha nel complesso caratteristiche che rispondono ai requisiti necessari per intraprendere, nel periodo neonatale, un programma di screening .
Tali caratteristiche sono di seguito elencate :
1. la FC  è relativamente frequente
2. è grave, tanto da imporre un pesante onere emotivo ed economico (alla famiglia e alla società)
3. il decorso della malattia è in parte modificabile dalle terapie
4. esistono attualmente tests con buona sensibilità e specificità e con costo relativo.

Sull'utilità dello screening neonatale e sul rapporto costo-beneficio si è sviluppato nel tempo un lungo dibattito. Esistono autorevoli opinioni sia a favore che contrarie alla procedura di screening. Il principale motivo per cui esistono queste disparità di opinioni è principalmente da ricercare nel fatto che, al momento attuale, i dati di follow-up dei periodi di screening non sono molto lunghi e non permettono di esprimere giudizi definitivi. Anche se non è stato finora dimostrato che lo screening neonatale migliori la prognosi a lungo termine, i risultati a medio termine sembrano incoraggianti e nel corso degli anni è emerso sempre di più che lo screening ha un'utilità sostanziale. Mentre in passato nello discussioni pro/contro lo screening neonatale erano gli scettici che richiedevano le prove dell'utilità dello screening,  attualmente il discorso  appare capovolto e agli scettici viene richiesto di fornire le prove sull'eventuale  mancanza di effetti positivi.

Quando si parla delle procedure di screening è necessario familiarizzare sui principali termini statistico/matematici che vengono utilizzati

1.  sensibilità. E' la proprietà di un test a risultare alterato nei pazienti affetti da una malattia. Esprime la capacità della procedura a riconoscere una malattia.
                  Sensibilità = veri positivi/veri positivi + falsi negativi (cioè tutti i soggetti malati)
2.  specificità  E' la proprietà di un test di risultare normale in soggetti esenti  dalla malattia. Esprime la capacità di escludere una malattia.
                   Specificità = veri negativi/veri negativi + falsi positivi (cioè tutti i soggetti esenti da malattia)

Sensibilità e specificità sono concetti importanti, vengono però desunti da casistiche costruite posteriormente alla diagnosi. In pratica non ci dicono che probabilità ha un bambino di essere malato.  Nella pratica di tutti i giorni ci si trova di fronte ad una realtà diversa ; il genitore  sa che il proprio bambino è risultato positivo allo screening neonatale per la FC, viene invitato dal Centro  e deve fare il test del sudore e vuol sapere subito qual'è il potere diagnostico dello screening. In pratica  ci viene rivolta questa domanda:  "il bambino è positivo ad un certo screening: che probabilità ho di essere davvero malato ?" Per rispondere a questa domanda  è necessario spiegare il significato di un altro indice che è il valore predittivo positivo. Il suo calcolo è dato dall'espressione :
veri positivi / veri positivi + falsi positivi (cioè tutti i positivi).

Tutte le procedure di screening, per qualsiasi malattia,  e i conseguenti accertamenti portano a individuare  4 categorie di soggetti.

1.  i positivi (soggetti con malattia)
2.  i negativi (sani)
3.  i falsi positivi (i soggetti risultati positivi allo screening che non hanno malattia)
4.  i falsi negativi (i soggetti risultati negativi allo screening che hanno la  malattia)
Ovviamente sono le ultime due categorie a creare i principali problemi. Nei falsi positivi, in attesa di eseguire gli accertamenti diagnostici che escluderanno la malattia, si vengono a creare ansie e stress che devono quanto prima essere risolte. Nei falsi negativi è intuitivo pensare alle pesanti conseguenze che possono essere attribuibili ad un ritardo diagnostico.
La procedura ideale di screening per la FC dovrebbe avere alta sensibilità e specificità ed alto valore predittivo positivo  generando il minore numero possibile di falsi positivi e falsi negativi.

Storia dei tests di screening per la FC

Un programma di screening neonatale per la FC è un insieme di procedure di laboratorio condotto nei neonati di una definita area geografica per individuare soggetti a rischio aumentato di FC.

I tests utilizzati possono essere eseguiti su meconio o su sangue.

A) Sul meconio. Hanno più che altro un'importanza storica e oggi vengono utilizzati solo parzialmente. Sono BM test, SQRID,  il QRID e la determinazione quantitativa della lattasi meconiale. Tutti questi test ricercano proteine meconiali e  si basano sulla presenza di un difetto di proteolisi presente alla nascita a livello intestinale nel 70% dei malati FC, probabilmente in relazione alla mancata secrezione di enzimi pancreatici. I tests sul meconio hanno una realtà più storica che attuale e solo la lattasi meconiale ha oggi un'utilità come test complementare di altre procedure.

B) Sul sangue. Anche per la FC, come per tutte le altre procedure di screening  eseguite nel periodo neonatale,  vengono oggi utilizzati degli spots di sangue che vengono analizzati in laboratori centralizzati. Il test che viene oggi eseguito richiede poche gocce di sangue con cui viene impregnata una carta da filtro per il dosaggio della tripsina con metodiche enzimatiche (IRT). I valori della tripsina nei pazienti  FC sono infatti alti alla nascita e questo è probabilmente da attribuire al reflusso della tripsina verso il torrente ematico per un ostruzione dei duttuli pancreatici. Valori elevati di IRT si possono tuttavia trovare anche in soggetti non FC e proprio per potenziare la specificità del test la raccolta della tripsina dovrebbe essere fatta in 4-5° giornata. Nei sani infatti l'IRT tende a normalizzarsi nei primi giorni di vita anche se alcuni soggetti possono avere una normalizzazione nelle settimane successive. I fibrocistici tendono invece a mantenere alti nel tempo tali valori e su questi concetti si basa la pratica del retesting, cioè la ripetizione della misurazione dell'IRT verso il mese di vita. La conoscenza dei dati riguardanti i valori di IRT nel periodo neonatale fa sì che tutte le varie tipologie degli attuali programmi di screening neonatale per FC si basano oggi in prima battuta su IRT, con un programma di controllo di qualità su campioni.
L'età consigliata per il prelievo è 48-120 ore di vita ma bisogna tener presente alcune condizioni particolari :
* la prematurità con sofferenza perinatale si accompagna a una più elevata percentuale di ipertripsinemia
* anche le situazioni malformative in genere si accompagnano a livelli elevati di IRT
* la presenza di ileo da meconio si accompagna a livelli elevati di IRT solo nel 50%

Il livello decisionale di screening (cut-off) per IRT deve essere sperimentalmente definito da ogni singolo laboratorio.  Il cut-off si basa sull'analisi statistica dei valori di IRT di almeno 5000-10.000 campioni ; poiché IRT non ha propriamente una distribuzione gaussiana il valore di cut-off è definito in base a procedure di analisi statistica non parametrica (percentili). La scelta del centile al quale fissare il cut-off è funzione dei livelli di efficacia del programma ed è un compromesso fra alta sensibilità e specificità e costi economici e sociali. In genere i programmi di screening neonatale dovrebbero caratterizzarsi per un indice di richiamo non superiore all'1% e la soglia scelta per il cut-off è di solito pari al 99° centile.

Tipologie di screening neonatale per la FC

A)  Programma biochimico a doppio richiamo
Prevede una prima determinazione dell'IRT. I soggetti con valore di IRT elevato vengono richiamati per eseguire un secondo prelievo entro una finestra temporale ben precisa (1 mese). Dovrebbe essere definito il percentile del secondo livello decisionale.
Con il programma biochimico a doppio richiamo ci si attende una sensibilità intorno al 90-95%.

B) Programma biochimico integrato (IRT + lattasi meconiale) a doppio richiamo
Prevede in associazione al dosaggio IRT la determinazione della lattasi meconiale. L'interpretazione di questo ultimo dato permette la riduzione dei richiamati e in certi casi consente di anticipare l'esecuzione del test del sudore.
Questo è il programma attualmente in uso per tutti i neonati della nostra regione

C)  Programma biochimico e molecolare, a doppio passo
Prevede una prima determinazione dell'IRT, seguita sullo stesso campione dalla ricerca di mutazioni per la FC. In base alle esperienze della letteratura lo studio molecolare consente di aumentare la sensibilità, la specificità e il valore predittivo positivo dello screening.
Il pratica gli spot con valori di IRT oltre la soglia vengono analizzati per le mutazioni del gene CFTR. Gli ipertripsinemici rappresentano una categoria di soggetti in cui la prevalenza della mutazione del gene FC è considerevolmente più alta rispetto alla popolazione normale. La condizione preliminare è l'esatta conoscenza delle mutazioni nella popolazione dell'area geografica interessata. E' ancora dubbio se questo programma di screening sia applicabile dal punto di vista  costo/beneficio in aree caratterizzate da notevole eterogeneità genetica per la FC come ad esempio la Toscana. Proprio