Microbiologia generale

 

 

Virulenza e patogenicità:

 

Prima di definire questi due concetti, ricordiamo la differenza che esiste tra infezione e contagio. Si dice che un microrganismo ha infettato l’uomo quando ne modifica il suo metabolismo provocando una patogenesi.

Definiamo la patogenicità come la capacità che ha un microrganismo di produrre una malattia nel suo ospite.

La virulenza è la capacità di un microrganismo a superare le difese immunitarie dell’ ospite. Infatti Miles definì la prima come l’insieme delle proprietà patogene di una specie o di un genere, e la seconda come l’ attributo di un singolo ceppo.

Schematicamente si possono distinguere tre aspetti che influenzano l’attività patogena: la crescita, le proprietà aggressive e le proprietà tossiche. A sua volta le proprietà tossiche le possiamo dividere in : tossine di importanza fondamentale, tossine che mantengono un ruolo importante ma non fondamentale, tossine prodotte in vitro la cui azione in vivo è indifferente e tossine prodotte in vivo ma difficilmente riscontrabili.

 

Citostruttura batterica:

 

I batteri hanno una struttura cellulare più semplice rispetto a le cellule eucariotiche. Infatti non presentano membrana nucleare, mitocondri o cloroplasti, e non hanno un reticolo endoplasmatico. Invece possiedono una struttura esterna molto più complessa. Dall’ esterno verso l’interna possiamo riconoscere le seguenti strutture:  flagelli, pili, capsula, parete cellulare, membrana cellulare, mesosomi, citoplasma ed equivalente nucleare.

 

Spore batteriche:

 

La produzione di spore è caratteristica esclusiva dei bacilli e dei clostridi (nei batteri di interesse medico). Analizzando da un punto di vista strutturale la spora possiamo distinguere tre strati che racchiudono un citoplasma, una membrana cellulare, e una parete cellulare rudimentali rispetto a quello della forma vegetativa.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                        Microbiologia speciale

 

 

 

                                     Micrococcaceae.

 

 

Stafilococchi:

           

            La cellula batterica ha forma sferica ed è gram-positiva aerobica facoltativa asporigena e immobile, si trova nell’aria,  nelle acque, sulla pelle e sulle mucose. Le due specie più importanti sono lo s. aureus e lo s. epidermidis. Sono distinguibili mediante tipizzazione sierologica e fagica. In base alla  seconda  tipizzazione si dividono in cinque gruppi. Sono facilmente coltivabili e sono stati formulati particolari terreni di coltura selettivi sfruttando le caratteristiche biochimiche degli stafilococchi, come la fermentazione del mannitolo. Causa affezioni suppurative come foruncolo, patereccio ed  ascessi e non suppurative come endocarditi, cistiti e meningiti. Può causare anche se raramente dei quadri clinici particolari come lo shock tossico e la sindrome della pelle ustionata del lattante. Tale polimorfismo patologico deriva dal fatto che gli stafilococchi possiedono molti componenti cellulari e producono una grande varietà di sostanze extra cellulari (enzimi e tossine).       Tra le proteine strutturali ricordiamo l’antigene polisacaridico della capsula (ac. D-glucosaminuronico.), il polisaccaride A, e il polisaccaride 263, la proteina di Werwy  caratteristica dei ceppi patogeni.

Tra gli enzimi ricordiamo la coagulasi, la fibrolisina, la ialuronidasi e la catalasi.

Le eso tossine sono classificabili in a(azione emolitica e dermonecrotizante), b(azione emolitica e citotossica), d(azione emolitica e dermonecrotizante) e inoltre produce la leucocidina che una proteina che agisce sulle membrane cellulari modificando la permeabilità selettiva al potassio. Le tossine causano l’intossicazione alimentare (enterotossina A la più importante), la sindrome dello shock tossico (esotossina pirogenica C), la sindrome della pelle ustionata (esfoliatina A e B)

 Crescono bene sui normali terreni di cultura e sopportano variazioni di pH.  Il colore varia dando varie specie, aureus, citreus, albus.  Acidificano il lattosio, il galattosio , glucosio e saccarosio e l’ identificazione diagnostica per quelli patogeni si effettua usando i criteri di patogenicità distinti in: fondamentali, accessori, e complementari.  Tra i primi ricordiamo la produzione di coagulasi e di DN-asi, nel secondo la fermentazione del mannitolo e tra i complementari la produzione di esotossine e l’elaborazione di lipasi e ureasi. Tra le ricerche di laboratorio possiamo annoverare anche la ricerca degli anticorpi anti stafilolisini nel siero del paziente.

 

Streptococchi:

           

            Sono immobili, asporigeni, gram-positivi e si dispongono in catenelle o a coppie; hanno larga distribuzione in natura e si trovano nelle acque, nel suolo, nella aria ed anche nella bocca e nella intestino della uomo.   Alcuni streptococchi sono patogeni per l’uomo. Si utilizzano 2 criteri di divisione; uno si basa sul comportamento che hanno sulle piastre agar-sangue e l’altro analizzando la struttura antigienica. Con il primo metodo si dividono in streptococchi a-emolitici b-emolitici g-anemolitici il secondo gruppo comprende i ceppi più virulenti e provocano infezioni suppurative  e patogenesi a carattere immunitario come la glomerulonefrite o la malattia reumatica. Il secondo metodo si basa sulla struttura antigienica costituita dal crbonato c che si trova sulla parete cellulare, dalla proteina m che è strettamente correlata con la virulenza del gruppo b a emolitico, la sostanza t che è un antigene che non ha nessun rapporto di virulenza con gli streptococchi e le nucleoproteine. Le tossine e gli enzimi sono la streptochinasi che è una fibrolisina e viene prodotta dai beta emolitici, la streptodornasi che è un enzima che depolimerizza il DNA, la ialuronidasi,  la tossina eritrogenica che è responsabile della scarlattina, le emolisine, la difosfopiridin-nucleasi, la streptolisina O e la S che produce l’ emolisi b. Si classificano in emolitici (a,b,g), streptococchi viridians che non producono emolisine, ed enterococchi come il fecalis che fanno parte della flora normale dell’ intestino, gli streptococchi lattivi.   Possono produrre come patologie l’ erisplea, la febbre pauperale, sepsi. Ricorrenti sono anche l’angina che è causata da gli streptococchi b-emolitici e si mostra con un arrossamento della faringe, l’ impetigine che è un infezione superficiale della cute porta alla formazione, specialmente nei bambini, di pustole, endocardite acuta e subacuta e patologie post-streptococciche come la nefrite e la febbre reumatica. Le prove diagnostiche si dividono in dirette ed indirette: quelle dirette utilizzano prima la piastra agar-sangue per vedere che tipo di emolisi producono. Per evidenziare il tipo a b-emolitico si utilizza la bacitracina, al contrario le ricerche indirette si basano sulla produzione di anticorpi ( USK, UASHA). Alcuni ceppi degli streptococchi beta emolitici producono una esotossina eritrogenica capace di provocare un esantema generalizzato e molto caratteristico che configura un quadro clinico chiamato scarlattina. A questa tossina, che oltre a provocare l’ esantema è anche cardio-tossica e nefro-tossica, l’ organismo risponde con una immunità permanente verso la tossina ma non verso lo streptococco produttore.

 

Pneumococchi:

        

         Sono diplococchi gram-positvi e con l’ invecchiamento possono presentarsi gram negativi, formano una colonia piccola e rotonda che inizialmente ha forma conica, su colture di agar- sangue causano a-emolisi. Ricavano energia fermentando il glucosio accompagnato da una produzione di acido lattico. La struttura antigienica si può dividere in antigeni tipo specifici e specie specifici. Nel primo gruppo c’è l’ antigene  SSS che un polisaccaride capsulare,  il pneumococco contiene una proteina M caratteristica. Nel secondo gruppo possiamo annoverare il carboidrato C ed un antigene profondo nucleoproteioco come stafilo e strepto cocchi.       Producono polmonite che è causata dai tipi 1-8 e 18, l’ inizio della polmonite è improvviso con brividi e dolore pleurico. Dalle vie respiratorie possono raggiungere i seni paranasali, l’ orecchio medio, e le meningi. Sono sensibili a molti farmaci antibatterici anche se recentemente è comparsa una certa farmaco resistenza. Per le diagnosi si utilizza l’ optochina che inibisce il loro sviluppo. Nei soggetti splenectomizzati l’ infezione da stafilococco può assumere un andamento gravissimo probabilmente per la mancata opsonizzazione della cellula batterica.

 

                  

                                     Corynebacteriaceae.

        

         Comprendono  microrganismi diffusi sia nel regno animale che vegetale e possono essere saprofiti o patogeni. Sono gram-positivi aerobi e caratterizzati dalla presenza di granuli nel citoplasma. Si dividono in patogeni per l’uomo (C. difterite e listeria) e saprofiti o pseudodifterici o difteroidi. La distinzione si fa poiché i secondi hanno un numero maggiore di granuli e perché producono una fosfatasi ed ureasi e non fermentano il glucosio e saccarosio.

 

Bacillo difterico:

        

         E’ un parassita obbligato dell’ uomo la sua localizzazione è a livella delle vie aere essendo un batterio aerobio. é gram-positivo immobile anche se con un trattamento in alcool prolungato può presentare gram negatività. La caratteristica principale è la presenza di granuli metacromatici detti anche volutina che sono costituiti da fosfati inorganici e piccole quantità di RNA, questi granuli si trovano ai poli della cellula. Molto pronunciato il pleimorfismo e la forma a clava. Si inattiva a 58 °C ed è sensibile alla luce, altamente patogeno poiché produce una esotossina sotto controllo genico anche se è condizionata dal profago beta e dalla presenza di Fe++ come dimostra lo studio di Peppenheimer. E’ l’ agente eziologico della difterite malattia che trasmette per via aerea colpendo preferibilmente i bambini. La struttura antigienica è composta da un antigene proteico di superficie e uno più profondo polisaccaridico. La localizzazione è prima a livello della mucose delle vie aere, poi l’ esotossina raggiungendo il circolo sanguigno può attaccare sistema nervoso, miocardio, i reni e le ghiandole surrenali. Ci sono 3 tipi di bacillo: il gravis, intermedius, mitis che danno i rispettivi gradi della patologia, anche se il mitis può provocare forme mortali. La diagnosi si fa colorando il materiale con il metodo di Neis-Gins anche se esiste il rischio di degli pseudodifterici che presentano anche  essi granuli. Per gli esami colturali i terreni di elezione sono Loefler, e quello di Pergola contenente siero di bue, tellurio di potassio e tuorlo d’ uovo e il batterio difterico si differenzia dagli altri poiché produce colonie grigie con il centro scuro, inoltre biochimicamente i criteri sono la produzione di catalasi e la fermentazione dei carboidrati. le prove in vitro per i ceppi patogeni sono la reazione di Elek e la tecnica immunodiffusione di Ouchterloy oltre la inoculazione nella cavia.

 

Listeria monocytogenes:

        

         E’ un cocco bacillo gram-positivo e può presentarsi sotto forma filamentosa, è provvisto di flagelli che li conferiscono grande mobilità. In base alle caratteristiche antigieniche si può dividere in ceppi. Quello che vive in Europa è il ceppo B e in alcuni paesi del Nord Europa è stato riscontrato il 4B. Il contagio avviene o per via aerea, alimentare, o per via transplacentelre nel neonato. L’ infezione evolve con faringiti, interessamento seni frontali, infezioni oculari e anche l’ apparato urinario. Può provocare aborto o provocare al feto meningite purulenta e talvolta sepsi. L’ aborto è provocato da una endotossina necrotizzante, per quanto riguarda gli antigeni la frazione lipidica non ha importanza mentre la virulenza è condizionata dalla parte proteica. Gli antigeni somatici li dividiamo in tipo O (9) e tipo H (5). la diagnosi diretta va fatta sulle urine e sulle escrezioni in genere o ricercare sui cadaveri; il germe cresce in terreni arricchiti con sangue di montone, cloruro di litio, e glicocolla. La prova biologica si fa sul topino e la diagnosi indiretta si basa sulla produzione di anticorpi nel siero dosandoli con la reazione di sieroagglutinazione o fissazione del complemento.

 

 

                                     Bacillaceae.

 

         La famiglia delle bacillaceae comprende 2 generi:  il Bacillus di cui fanno parte li sporigeni aerobi, e i clostridi di cui fanno parte gli anaerobi. Nel primo gruppo l’ unica specie patogena è il B. antraci, mentre nel secondo gruppo troviamo i più importanti, per la microbiologia medica, che tratteremo dettagliatamente.

 

Bacillo del carbonchio (B. antracis):

 

         Si presenta sotto forma di bastoncello gram-positivo immobile con le estremità concave, il suo abita naturale è l’intestino dell’ uomo o degli animali anche se le sue spore si possono trovare nel suolo. Cresce bene sui normali terreni di coltura e sui terreni solidi danno origine a colonie grandi di aspetto rugoso che presentano la caratteristica forma a caput medusae, nel brodo da colonie a fiocchi bianchi che sedimentano e talvolta formano la pellicola nei reperti anatomo-patologi si presenta in bravi catene con pochi elementi circondati da una capsula. Per la struttura antigienica si distinguono quelli capsulati di natura polipeptidica, ac. d-glutammico e quelli polisaccaridi e nucleoproteici. E’ l’agente eziologico del carbonchio una malattia che contagia soprattutto gli animali. Il contagio avviene per causa degli animali morti o da quelli che disseminano le feci che infettano il suolo dove le spore resistono per lungo tempo.  Nell’ uomo l’ infezione si ha attraverso la cute lesa o integra. L’ azione patogena è data da una potente esotossina che è costituita da tre fattori: I edema factor, protective factor, letal factor; di questi tre il cofattore indispensabile è il secondo. Le analisi possono essere o biologiche inoculando nel topino, o microscopiche; quelle immunologiche hanno scarso valore.

 

Clostridio del tetano:

 

         E’ un ospite abituale dell’ intestino dei cavalli e occasionalmente dell’ uomo, così attraverso le feci degli animali che si insidia nel terreno avendo una forma sporigena molto resistente. Nella forma vegetativa si presenta con forma allungata concava ai lati gram-positiva mobile. Mentre nella forma sporigena presenta la spora ad una estremità avendo una classico aspetto a bacchetta di tamburo. Si distinguono due tipi di antigeni ciliare (H) e somatico (O), del primo ci sono 10 gruppi del secondo 2. E’ l’ agente eziologico del tetano, non ha grande potere di penetrazione, ma una volta entrato per mezzo di una lesione cutanea germina con periodi di incubazione che vanno dai giorni ai mesi. L’ azione patogena è svolta da una esotossina che raggiunti i centri nervosi periferici e centrali li inibisce con compromissione dei centri bulbari. La tossina si divide in 2 componenti: tetano-spasmina che la componente letale  e la tetanolisina ad azione emolitica. addizionando la tossina al formolo si ottiene l’ anatossina con potere antigene. L’esame batterioscopico non è molto utile meglio sviluppare colture in agarsangue agar cioccolato, tioglicato tutte in anaerobiosi, sull’agar-sangue si presenta prima a-emolitiche poi b-emolitiche.

 

Clostridio del botulino:

 

         E’ un bacillo gram-postivo, immobile con estremità arrotondate. Le spore so centrali e comunque scarsamente debordanti; si trova nel suolo e nel materiale fecale. E’ l’agente eziologico del botulismo una malattia che non può considerarsi infettiva in quanto il C. si trova soprattutto in cibi conservati in anaerobiosi. La suo azione patogena è dovuta ad una esotossina che si lega alle terminazioni nervose periferiche provocando morte per arresto cardio respiratorio. Si distinguono 6 esotossine differenti di cui solo il tipo A, B, E sono responsabili della patologia umana. una volta fissatasi ai centri nervosi la tossina non può essere eliminata dall’ antitossina. La diagnosi va fatta inoculando nella topo o brodo dei cibi contaminati o siero del paziente che ha contratto la patologia, si può anche eseguire la cultura in anaerobiosi anche se ha scarso valore.

 

Clostridi della gangrena gassosa:

 

         I clostridi della gangrena gassosa sono numerosi infatti abbiamo il welchii, il novyi, il septicum ed altri. Sono gram-positivi anaerobi e sporigeni e si trovano nel suolo. Sono l’agente eziologico della gangrena gassosa che è caratterizzata da una necrosi dei tessuti che sono colpiti. Si sviluppa maggiormente su tessiti profondi, e si piò dividere in due tipi: Il tipo benigno detta cellulite anaerobia, e il tipo maligno che colpisce i tessuti profondi, la gangrena gassosa. L’ azione è data da alcune tossine, le più studiate sono quelle del welchii che ne possiede 2. Una detta a ad azione emolitica che è una lecitinasi calcio dipendente e si ritiene che sia la più tossica, e l’ altra la q emolitica necrotizzante ma non idrolizza la lecitina. L’ esame può essere batterioscopico oppure per meglio fare la diagnosi va fatto l’ esame colturale su brodo tioglicato e su agar sangue contemporaneamente in aerobiosi ed in anerobiosi. I clostridi si svilupperanno solo nel primo che poi dovrà essere arricchito con calore per  eliminare gli altri batteri che non producono spore. Il welchii non può essere isolato così poiché non produce spore in coltura. L’ altro esame è quello biochimico.

 

 

                                                 Neisseiriaceae

 

         Sono diplococchi gram-negativi asporigeni ed immobili e si presentano a forma di rene o di fagiolo. Il genere comprende specie saprofite ( cataralis, flava, sicca), e specie patogene che sono di interesse medico, precisamente il meningitis e il gonorrhoeae.

 

Menigococco:

 

         La via d’ ingresso del meningococco e la regione rino-faringea, e il contagio avviene per via aerea, i germi poi passati nel sangue possono raggiungere le meningi. Sono cocchi gram-negativi immobili, asporigeni ed aerobi.  Sono noti 4 sierotipi di meningococco(A, B, C, D), possiede diversi antigeni: uno proteico (P) comune col gonococco e al pneumococco, una glicidica ed uno polisidico. La diagnosi diretta prevede la semina di materiale prelevato da sangue, liquor, essudati. Nelle clorazioni si presentano gram-negativi, E i terreni che si utilizzano sono agar-sangue, agar-siero, agar-cioccolato

 

Gonococco:

 

Morfologia e identificazione: E’ un batterio gram-negativo aerobio che si presenta in forma diplococchica dotato di fimbre. Fermenta solo il glucosio  ed è ossidasi positivo. Struttura antigene: Ha una struttura complessa e distinguiamo tre tipi di antigeni, sostanza P (in tutte le neisserie), Sostanza C(in molte neisserie), e agenti tipo-specifici di natura proteica. Azione patogena ed immunità: E’ l’agente eziologico della gonorrea una malattia a trasmissione sessuale.  Il batterio si riproduce sulle mucose genitali maschili e femminili in seguito al contagio, Nel maschio l’infezione si estende dall’ uretra alle vescicole seminali alla prostata e all’ epididimo con secrezioni purulente a livello uretrale; nella donna dalla cervice uterina con secrezioni più copiose. Caso particolare è la congiuntivite gonococcica dovuta al passaggio del feto attraverso il canale materno infetto, per questo si usa applicare pomate antibiotiche nel socco congiuntivale dei neonati. Reperti clinici: Nel maschio urina e secrezione, nella femmina si fa anche il tampone cervicale. Esame microscopico e coltivazione: La colorazione Gram ha valore diagnostico e si può fare lo striscio  su vetrino con blu di metilene per vedere la forma.  A causa della sua fragilità va coltivato immediatamente, i terreni usati sono l’ agar-ciocclato che non è selettivo, e il Thayer martin che è selettivo per le neisserie, le piastre vanno incubate per 48 h a 37 °C con il 10% di CO2  Sierologia e Terapia: Esistono tecniche diagnostiche efficaci come l’ EIA, l’ ELISA, e il RIA. Il trattamento antibiotico è facile poiché il gonococco è sensibile a quasi tutti gli antibiotici, importanti le misure di prevenzione igienica nei rapporti sessuali e il preservativo.

 

 

                                                Enterobacteriaceae

 

E’ un gruppo di batteri che comprende sia specie patogene, patogene opportunistiche, e saprofite. La morfologia è bastoncellare sono gram-negativi  e alcune specie sono mobili grazie ai flagelli. L’ habitat naturale è il suolo ma si trovano anche nelle acque, nelle piante e nel tratto intestinale degli animali. A causa della difficile differenziazione con le caratteristiche morfologiche si utilizzano criteri biochimici e antigienici. Per i primi si procede analizzando, l’ utilizzazione di particolari substrati per ottenere carbonio ( acetato, malonato, citrato); la produzione di determinati enzimi ( lisina, ornitina, decarbossilasi, b-galattosidasi); Produzione di metaboliti specifici; capacità di fementare particolari carboidrati.  Le caratteristiche antigieniche si dividono in tre tipi somatiche(O), Flagellari(H), di Superficie o Capsulari (K).

 

Escherida coli

 

Morfologia e identificazione: E’ un bacillo gram-negativo, aerobio asporigeno e fermentante. Generalmente è flagellato ed è glucosio (con produzione di gas), lattosio+, H2S-, indolo+, ureasi-. Struttura antigene:  Possiede tutti e 3 i tipi di antigeni. Si distinguono 160 tipi diversi di O, 100 tipi di K suddivisi in A, B, L e 60 tipi di H che a volte può mancare. Azione patogena e immunità: E’ normalmente presente nell’ intestino dell’ uomo dove vive da saprofita producendo vitamine del gruppo B, Talvolta può causare infezioni enteriche causati da ceppi produttori di enterotossine, e provocano la classica diarrea del viaggiatore. Si possono anche riscontrare nelle infezioni urinarie. Reperti ed esami microscopici e colturali: Sangue, urine, bile ed escreato. La coltivazione non ha valore diagnostico, i terreni sono il McConkey Agar e il Levine Agar contenenti bile per inibire la flora gram+. Sierologia e Terapia: Si utilizza la tecnica al lattice di agglutinazione passiva per dimostrare la produzione di tossina. Per la terapia conviene fare un antibiogramma, anche se gli antibiotici più usati sono cloramifenicolo, le tetracicline, e le colimicine.

 

Klebsielle (pneumoniae)

 

Morfologia ed identificazione:Gram- asporigeno, corto, tozzo e immobile. Indolo-, lattosio+, citrato+, H2S-, ureasi+. Struttura antigene ed azione patogena:  Sono presenti gli antigeni O e K, di solito fa parte della normale flora batterica delle vie respiratorie ma può provare infezioni in condizioni particolari e si distinguono tre sottospecie patogene: Pneumoniae causa polmoniti e bronchiti, Ozaenae causa l ‘ozena malattia della mucosa nasale, Rhinoscleromatis porta infezione granulomatosa alla rino faringe. Prove di laboratorio e terapia: Essudato, urine, espettorato. Cresce sui normali terreni di coltura per enterobatteri. E’ meglio affidarsi all’ antibiogramma anche se sono attivi cefalosporine e aminoglicosidi.

 

Salmonelle

 

Morfologia ed identificazione: (S. Typhi) E’ di forma bastoncellare con flagelli peritrichi e asporigeno.        

Ha caratteristiche biochimiche complesse, lattosio variabile, saccarosio-, mannitolo+, citrato+, H2S+, indolo+, ureasi-. Struttura antigene: E molto importante, ci sono antigeni O che stimolano la formazione di IgM, antigeni flagellari H che sono distinti di 2 forme, e antigeni K che sono divisi in distinti in 3 tipi: Vi, 5, M. Il più importante è il Vi poiché è correlato con la virulenza bloccando l’ attività fagocitaria. Azione patogena e immunità: E’ la causa della febbre tifoide. Il batterio penetra nell’ organismo attraverso la via orale e superata la barriera gastrica si localizza nell’ intesino tenue da dove raggiunge i linfonodi mesenterici per poi immettersi nel circolo  sanguigno. A questa fugace batteremia segue la localizzazione nel reticolo endoteliale, ove si mopltiplica rapidamente per riversarsi di nuovo in circolo dando luogo a un batteremia più imponente (rialzo termico e comparsa dello stato tossico). Un gran numero di salmonelle si localizza a livello delle placche del Peyer  ove si moltiplica ricolonizzando l’ intestino e causando le complicanze classiche della fase tardiva (enteropatia e peritonite da perforazione). In questa fase viene anche colonizzata la colecisti ove le salmonelle possono rimanere dopo la guarigione clinica dando luogo alle recidive. Questo meccanismo patogenetico ci chiarisce il classico decorso della malattia in era pre antibiotica in quattro settenari. Il primo corrisponde alla prima fase batterimica, il secondo alla fase setticemica e tossica, il terso alle complicanze intestinali e il quarto alla fase della guarigione. I test sono: sierilogici (reazione di agglutinazione di Widal e colturali emocotura, coprocoltura e mielocoltura).

 

Protei

 

Sono dei batteri gram negativi, si distinguono 4 specie: vulgaris, mirabilis, morganii, rettgeri. Sono saprofiti delle vie digerenti e urogenitali dell’ uomo oltre a trovarsi negli organismi in putrefazione. Hanno un elevato polimorfismo che li permette di presentarsi sotto forma filamentosa o cocco-bacillare; resistenti al calore sono mobili per la presenza di ciglia. Questa caratteristica si utilizza per il riconoscimento dato che coltivati su agar mostrano il fenomeno della sciamatura. Si distinguono antigeni O e H, riconoscendo nelle specie vulgaris e mirabilis 49 antigeni O e 19 H, mentre nelle specie morganii e rettgeri 57 e 45. Le modalità di contagio possono essere quella relativa alla virulentazione dei ceppi intestinali e quella esogena. La patologia presenta caratteristiche peculiari infatti causano fenomeni infiammatori a carattere purulento dell’ apparato urinario, o provocando processi suppurativi su piaghe e ustioni. sono stati anche isolati da otiti, mastoditi, meningiti, pleuriti e peritoniti. I terreni colturali sono quelli classici per gli enterobatteri come il Mac-Conkey e L’agar-SS e di solito danno colonie incolori. tra le prove biochimiche ricordiamo la fenilalaninadeaminasi, e la ureasi. Importanza riveste anche la prova di Weil e Felix dove vengono agglutinati i protei dal siero di pazienti dermotifosi.

 

Shigelle

 

Sono cocco bacilli gram-negativi, immobili e dotati di fimbrie con probabile funzione ai fini degli scambi nutritivi. Il loro abitat è l’ intestino crasso dell’ uomo e di alcuni mammiferi superiori. Si distinguono 4 generi diversi indicati con le lettere A, B, C, D. queste suddivisioni si basano sia sulla struttura antigenica del batterio sia sulle caratteristiche biochimiche. I germi penetrano attraverso la via orale, sono facilitati dall’ abbondante assunzione di liquidi che diminuiscono l’ acidità gastrica. Superato il tenue si localizzano nel colon dove svolgono l’azione patogena per mezzo di tossine. La dissenteria bacillare è caratterizzata da febbre, dolori addominali, diarrea con feci mucosnguinolenti. La malattia decorre in forma epidemica anche se ora è ristretta ai paesi con scadenti condizioni igieniche. Hanno notevole importanza anche le mosche come insetti vettori . La struttura antigenica è data da antigeni di tipo K e di tipo O, Questi ultimi sono complessi glicoproteici, con specificità sierologia legata al polisaccaride mentre la proteina rappresenta la tossina, gli an. K sono superficiali e mascherano molto spesso quelli O. L’ esame microscopico delle feci può dare un primo orientamento, ma la diagnosi con certezza si ha solo con le inseminazioni sui terreni come MacConky ed agar SS dopo incubazione le colonie sospette vengono isolate mediante le prove biochimiche come lattosio - e le prove di agglutinazione. la diagnosi indiretta si esegue a partire da 12 giorno ricercando nel siero gli anticorpi agglutinanti la shigella, però per avere un valore attendibile la sierodignosi deve raggiungere almeno un titolo di 1:50 per la specie dysentriae e d 1:150 per le altre.

 

 

                                                Pseudomonaceae

 

 

 

Pseudomonas aeruginosa

 

E’ un batterio gram-negativo, mobile per la presenza di flagelli polari, asporigeno, a capsulato. Diffuso in natura può vivere saprofita sulla cute o ritrovarsi nell’ acqua o nel suolo dove partecipa alla demolizione putrefattiva delle sostanze organiche. Per questa sua ubiquitarietà può penetrare nell’ organismo in diversi modi, dalla cute, attraverso la rinofaringe o attraverso le vie genito-urinarie, comunque può anche essere causa di otiti e meningiti. Affinché esplichi la sua azione patogena c’è bisogno che si verifichino opportune condizioni come le ustioni o nei soggetti immunodepressi visto il suo scarso potere invasivo.Presenta antigeni somatici, flagellari, proteici. La sua principale caratteristica è di produrre pigmenti colorati sui terreni di coltura (piocianina, floresceina, piorubina). dalle suo colture sono state estratte anche delle tossine come la piocianolisina, e una tripsina. La dignosi diretta prevede l’esame batterioscopico sul materiale infetto, mentre quello colturale si fa su TSA, agar-sangue, e sui terreni selettivi come l’ agar-cetrimide; altra caratteristica è l’ essere aerobio obbligato.comunque importantissime sono le prove biochimiche visto che i pigmenti non sempre vengono prodotti in coltivazione. La più importante di queste prove è il test dell’ ossidasi.

 

 

                                     Parvobacteriaceae

 

 

Pasturelle

 

E’ un microrganismo di forma bastoncellare gram-negativo riconoscibile per la sua tipica colorazione bipolare che li conferisce un aspetto a navetta. In base ai caratteri colturali, patogeni e antigienici distinguiamo 4 specie per le pasteurelle: pestis, multocida, tularensis, pseudotubercolosis.

La prima è un coccobacillo agente eziologico della peste. Cresce sui terreni colturali arricchiti con sangue e siero. E’ ospite di alcuni roditori ed è veicolato sull’ uomo dalle pulci. Clinicamente le forme di peste si distinguono in bubbonica, setticemica, polmonare. La struttura antigenica è composta da 3 antigeni superficiali e dalla presenza di una endotossinache blocca i processi di ossidoriduzione. Il materiale infettato si semina su agar, su Leipson, o sul terreno di Morris, la diagnosi diretta si avvale della sieroagglutinazione.

La P. multocida si riscontra nelle vie respiratorie di moltissimi mammiferi. Gram-negativa, bastoncellare ha antigeni tipo-specifici e costituenti della endotossina. Le indagini si fanno su terreni arricchiti.

La P.tularensis nell’ uomo da origine a lesioni nodulari, le tecniche diagnostiche si rifanno alla sieroagglutinazione.       La P. pseudotubercolosis contagia l’uomo per la via alimentare o cutanea. l’infezione produce una adenite mesenterica o enterite. La diagnosi viene fatta con sieroaglutinazione.

 

Brucelle

 

Sono microorganismi gram-negativi di forma coccobacillare. Si conoscono quattro specie: abortus, melitensis, suis, neotomae. La più patogena è la seconda che è responsabile della febbre di Malta o febbre ondulante, detta cosi per questa caratteristica. L’ infezione può avvenire o ingerendo latticini contaminati (via indiretta), o per lesioni alla cute (via diretta), o per contatto con materiale infetto. dopo essere penetrata nell’ organismo attraversa la mucosa gastrica (se è contagio indiretto) per poi tramite il torrente circolatorio insediarsi nel sistema reticolo endoteliale e da li nella milza, nel midollo osseo, e nel fegato. La si può trovare anche nei testicoli , nelle articolazioni, nelle meningi, nelle pleure, e nei polmoni. Dotate di catalasi con la quale svolgono un azione patogena, possegono un antigene O. Alcuni ceppi di B. abortus possiedono un antigene capsulare L. L’ esame batterioscopico è poco efficace, mentre ha valore quello colturale. l‘ emocoltura si esegue durante il periodo piretico, mentre la mielocoltura è indicata casomai fallisce il primo esame. Crescono lentamente (da72 ore a 15 gg.) ma vengono facilitate dall ‘aggiunta di siero, liquidi ascitico, sangue, estratto di fegato, glicerina e latte. Le prove biochimiche sono la fermentazione del glucosio, da parte della melitensis, la ricerca indiretta si avvale del test di Wright.

 

Emofili

 

Gli emofili,  che si dividono in Haemofilus, pertussis, influenzae, e ducrey sono parassiti obbligati dell’ uomo. Sono coccobacilli gram-negativi, immobili, asporigenie assumono la colorazione bipolare a navetta. Il pertussis da la pertosse malattia che si contagia tramite le goccioline di saliva. il batterio causa lesioni specifiche all’ apparato respiratorio durante gli accessi di tosse. L’ H. influenzae vive sotto la forma R a livello delle vie respiratorie superiori, può occasionalmente trasformarsi in forma S patogena causano infezioni come meningiti od otiti. Il Ducrey produce una malattia venerea, l’ ulcera molle di Ducrey, che si trasmette con i rapporti sessuali. Le caratteristiche morfologiche non permettono di distinguere le specie, ci sono differenze a livello antigienico,  il pertussis possiede un antigene dotato di potere tossico, l‘ H. nfluenzae ne possiede uno somatico e uno proteico, sul ducrey non si sa molto. Richiedono semina su terreni al sangue soprattutto hanno bisogno dei fattori V e X, comunque non tutti anno bisogno di entrambi ma qualche volta possono utilizzarne uno solo.( influenzae + a tutti e due, ducrey X+). Il pertussis cresce bene sul Bordet Gengou alla penicillina essendo resistente a questo antibiotico. Gli esami indiretti si basano su reazioni di fissazione per il pertussis e sulla intramordenzazione di Ito-Reensterina per il ducrey.

 

 

                                     Vibrionaceae

 

 

Vibrione del colera

 

Ha una forma bastoncellare leggermente incurvato, gram-negativo, mobile e in coltura si presenta in isolato o in corte catene. Si trova nel tubo digerente dei primati o nelle fogne e nelle acque fluviali. Venendo assunto per via orale provoca l’ infezione a livella dell intestino tenue dove si localizza provocando una desquamazione dell ‘ epitelio con diarrea ed eliminazione rettale di cellule. Ha un periodo di incubazione piuttosto breve ed esordisce bruscamente con scariche diarroiche. I vibrioni liberano numerose esoenzimi (neuroamidasi) e possegono endotossine come quella di tipo 1 e quella di tipo 3 e 2 che agisce direttamente, producendo prostaglandine, sull’ adenil-ciclasi che provocando un aumento di c-AMP attiva il trasporto degli ioni. Possiede anche antigeni flagellari. Sono distinguibili i ceppi Inaba, Hikojima e Ogawa in base ai tre di antigeni A, B e C. Per la dignosi di colera si esegue una ricerca diretta sulle feci o sul vomito, oppure con tecniche sierologiche. Il campione viene  prelevato prima di qualsiasi trattamento antibiotico e viene inseminato su terreno di arricchimento (aqua peptonata alcalina), poi  su terreni selettivi (Monsur, TCBS), o su terreno di Kliger. Comunque lo schema diagnostico può essere così rappresentato:  Campione----> ric. microscopica in campo oscuro---> terreno di arricchimento----> terreno selettivo----> Agglutinazione preliminare---->  terreno di Kliger----> Seconda agglutinazione. gli esami immunologici Hanno scarso valore.

                                     

 

                                     Mycobacteriaceae

 

 

Micobatterio della tubercolosi

 

E’ un bacillo molto sottile, immobile, asporigeno, aerobio, gram-positivo, alcool-acido resistente, con la caratteristica di crescere con molta lentezza a causa della sua membrana cellulare molto ricca in lipidi che ostacola l’ assorbimento delle sostanze nutritizie essendo idrorepellente. I lipidi possono rappresentare anche il 40% del peso totale conferendoli una spiccata resistenza a gli acidi e a gli alcali (questa caratteristica viene sfruttata per avere lo sviluppo vincolato). Tra i lipidi particolare importanza c’è la cera D responsabile dei fenomeni di ipersensibilità ritardata; invece la frazione fosfolipidica è responsabile dei fenomeni di trasformazione cellulare che conducono alla formazione del tubercolo. La patogenicità comunque è data dal fattore cordale, e dalla produzione di catalasi. Sono distinguibili i ceppi umano, bovino, aviario e murino; per l’uomo sono patogeni solo i primi due. i ceppi sono distinguibili fra di loro solo attraverso la provabiologica. L’ infezione avviane per via aerea a causa dei malati che eliminano il batterio. Abbiamo due tipi di infezione: la primaria che è rappresentata da una lesione infiammatoria di tipo essudativo con l’interessamento dei linfonodi regionali (complesso primario) che va sempre incontro a guarigione. La TBC-post primaria si presenta in pazienti che non sono riusciti ad eliminare il complesso primario a causa del basso livello d’ immunità. Ci sono Tre tipi di TBC: la polmonare, che si localizza solo a livello dei polmoni; la miliare, che è una sepsi tubercolare che si instaura in seguito alla diffusione del bacillo; l ‘extrapolmonare che a differenza della miliare a un carattere meno virulento. La prima infezione produce una resistenza alle seconde infezioni, questa esistenza è evidenziabile con il test di Mantoux (per puntura semplice), di Rosenthal (multipuntura), o con il Tine-test (via percutanea). La diagnosi si basa sulla evidenziazione del batterio nei materiali patologici, con colorazione di Ziehl-Neelsen, seguita dalle prove colturali sui terreni di Petrgnani, Dubos,o IUTM. 

 

Micobatterio della lebbra

 

Detto bacillo di Hansen si presenta sottile, con estremità arrotondate, incurvato, gram-positivo, alcool-acido resistente. E’ l’agente eziologico della lebbra, essendo parassita obbligato dell’uomo (vive nella cute, nei testicoli, nei nervi periferici).

Abbiamo due forme di lebbra: la prima ,detta nodosa, con caratteristici noduli cutanei o mucosi (lepromi);

la seconda, detta nervosa, che produce disturbi della sensibilità, lesioni distrofiche, ulcerazioni profonde mutilanti. Non è coltivabile, anche se sembra capace di moltiplicarsi su terreni artificiali acellulari; la diagnosi si basa sulla ricerca diretta sul materiale patologico, ricorrendo immediatamente alla colorazione di Ziehl-Neelsen. Scarsa importanza riveste la prova di Mitsuda.

 

 

                                     Spirochaetaceae e Treponemataceae

 

Terponemi

 

 treponemi hanno dimensioni medie tra borrelie e le più piccole leptospire. possono essere evidenziati al micr ott in campo scuro o in contrasto di fase. Sono anaerobi obbligati e difficilmente coltivabili in vitro, il più importante è il pallido  che agente eziologico della sifilide. Altre specie patogene di malattie tropicali come il pertenue e i carateum che sono della framboesia e della malattia detta pinta;  inoltre altri ceppi sono il calligarum e il genitalis. La sifilide è una malattia venerea ad andamento cronico intermittente, l’ infezione può essere di due tipi, per contagio indiretto o diretto. nel primo caso si ha in seguito a contatto sessuale, mentre più raro è il secondo caso non venereo dato che Il treponema pallidum non riesce a vivere al di fuori dell’ organismo, terza via di contagio è quella placentare. Penetrato attraverso le lesioni cutanee o attraverso le mucose dei genitali dopo tre o 4 settimane comincia a dare i primi segni di infezione clinica: il sifiloma primario. Il sifiloma guarisce spontaneamente dopo 2 o 3 settimane ma dopo 1 o3 mesi può seguire  sifilide secondaria con lesioni a carico della cute, esantema sifilitico, e delle mucose. Infine si verifica la sifilide terziaria nella quale le lesioni hanno carattere distruttivo ed estremamente grave. In questa fase osserviamo i sifilodermi. La sifilide placentare porta a morte il feto o comunque gravi lesioni a carico del neonato delle ossa e del fegato. Gli antigeni conosciuti per gli esami di laboratorio sono: L’ antigene di Wasserman, l’antigene proteico di gruppo, e l’antigene proteico di Reiter. Il primo è noto come cardiolipina o antigene lipoideo essendo chimicamente un difosfatilglicerolo che viene impiegato nella reazione di Wasserman. Il secondo è usato nei test di immobilizzazione treponemica o TPI presente nel ceppo NCHols, l’ultimo è RP o Reiter protein. E’ una proteina presente nel ceppo di Reiter a patogeno coltivabile in vitro. La dignosi si basa sulle prove indirette come la prova di Wasserman, sono anche la reazione di flocculazione, la reazione di Nelson, e Di Mayer oltre che la reazione di immunoflorescenza indiretta FTA.

 

Borrelie

 

La più comune Borrelia e la recurrentis che ha una lunghezza variabile tra i 10 e i 30 m. E’ avvolta a spirale con le estremità appuntite. la si può evidenziare con l’esame a fresco dato che risulta gram-negativa, oppure con la colorazione Giemsa determina nell’ uomo la febbre ricorrente distinguibile in quella da pidocchi, avente carattere epidemico, e de zecche che non assumono mai diffusione epidemica. La malattia inizia con febbre elevata, cefalea, epato e splenomegalia. La febbre e intermittente, le complicanze più gravi portano alla cecità. La diagnosi si esegue per via diretta ricercando le borrelie nel sangue.

 

Leptospire

 

La leptospira è visibile con l’esame a fresco con microscopio ottico in campo scuro, si presenta sotto forma di

filamenti di lunghezza 7-20 m si colora con i colori di anilina e con il metodo Giemsa. Ha scarsa resistenza agli agenti chimici e fisici e la sua temperatura di crescita è compresa tra i 15 e i 30 °C e il suo pH è di 7,2. Le leptospirosi sono infezioni veicolate all’ uomo da animali selvatici e domestici fra i quali riveste particolare importanza il topo campagnolo ed i ratto; in questi animali la leptospira si annida nei tubuli renali, contaminando attraverso le urine, le acque e il suolo. La leptospirosi cominciano con un quadro setticemico acuto, caratterizzato da febbre elevata, cefalee, insonnia, nausea, vomito e ipotensione arteriosa. La fase setticemica si esaurisce do 6-9 giorni. Nella seconda fase tendono a scomparire dal sangue per localizzarsi a livello dei reni e del fegato e delle meningi. La struttura antigenica è composta da antigeni superficiali (p) o profondi (s). Le leptospire di maggiore interesse sono la icteroemoraghagiae che provocano il morbo di Weil, la grippotyphosa che provoca la febbre dei campi, e la bataviae che provoca la febbre delle risaie.La ricerca diretta si effettua sulle urine, si coltivano facilmente nel terreno di Karthof che contiene soluzione salina addizionata con peptone. A scopo diagnostico la reazione più usata è quella di agglutinazione che si basa sulla ricerca nel siero del paziente di agglutina specifiche, utilizzando come antigene una sospensioni di leptospire vive. Esiste pure il vaccino che è costituito dai tipi icterohaemorragiae e bataviae.

 

 

                                     Rickettsie

 

Le Rickettsie hanno un comune coni virus le dimensioni notevolmente inferiori a quelle dei batteri e l’ incapacità di replicarsi al di fuori di cellule, comunque possiedono un organizzazione biologica cellulare procariotica. Con corredo enzimatico complesso per cui sono considerate batteri. Sono parassiti di alcuni artropodi che vengono trasmessi per puntura a un ospite vertebrato tra cui l’uomo causando la patologia. Hanno la forma di cocchi o di coribastoncelli sono difficilmente analizzabili con la colorazione gram mentre si colorano rapidamente con il blu o con la colorazione di Giemsa o di Machiavello. Hanno una parete cellulare ben sviluppata, una zona nucleare filamentosa posta al centro del citoplasma e si replicano per scissione binaria. La composizione della parete cellulare è simile a quella degli altri batteri il loro parassitismo è dovuto alla esigenza di dover ricevere dalle esterno enzimi come la mao o il coenzima A necessari per la loro sopravvivenza. Sono coltivate nel sacco vitellino di uova embrionate ed in numerosi tipi di colture cellulari. Si distinguono 2 tipi di antigeni uno solubile e il secondo legato alla cellula specifico per ciascuna specie. Le patologie delle rickettsie dipendono dalla via d’ ingresso che è ematica tranne per la febbre Q trasmessa per via respiratoria. I batteri entrati nel sangue dopo la puntura si moltiplicano nelle cellule die piccoli vasi, proliferano con formazione di trombi, essudati infiammatori ed emorragie circoscritte. si possono trovare anche lesioni cutanee delle mucose e del cervello. Distinguiamo 4 gruppi. I primo detto gruppo del tifo comprende la provazeki (tifo epidemico) e la monoseri ( tifo endemico) la prima è trasmessa della pidocchio dei vestiti mentre la seconda ha come serbatoio altri pazienti infetti. Il tifo endemico viene provocato dalla puntura delle pulci e dei pidocchi del ratto con manifestazioni cliniche con un periodo d’ incubazione di 1-4 settimane con brusca insorgenza di febbre e cefalee seguita con eruzione cutanee petecchiale, con stati stuporosi e schok con mortalità elevata. Abbiamo poi altri gruppi come quello della febbre fluviale del Giappone e quello delle febbri bottonose, che differisco dagli altri per la capacità di riprodursi sia nel nucleo, che nel citoplasma. L’ ultimo gruppo è quello della febbre Q. si differenzia dalle altre rickettsie per la capacità di vivere in ambienti extracellulari,, possono anche essere coltivate in mezzi a cellula facendo la diagnosi con l’isolamento sul materiale patologico inoculate diretta mente nel sacco vitellino o diagnosi più comune è quella indiretta dimostrando la presenza di anticorpi la reazione di Weil Felix basata sulla agglutinazione di ceppi di proteus vulgaris che sono in grado di reagire con il  polisaccaride del proteus. Questa reazione no vale per la febbre Q.

 

 

                                     Calmidie

 

Le clamidie sono parassiti intracellulari obbligati, sono più piccole delle rickettsie, tonto che allungo furono considerate come grossi virus. Sono parassiti dei mammiferi e degli uccelli in base a lo spettro d’ ospite si possono distinguere in agenti aviari, agenti umani, ed agenti dei mammiferi. Una seconda classificazione si basa sulle caratteristiche antigieniche li divide nei generi bedsoria e clamidzoon. Sono tra loro morfologicamente indistinguibili si presentano come granuli intra citoplasmatici di 02-05 micron. Quindi appena visibili al microscopio ottico.  Si colorano con la colorazione di Machiavello e di Gimensa. Dipendono dalla cellula ospite soprattutto per esigenze metaboliche più delle rickettsie. Sono sensibili al cloramfenicolo e alle tetracicline a anche ai sulfamidici. Possono essere coltivati su membrana Corionallantoidea di uova embrionate o su colture di fibroblasti di topo. Le infezioni possono dipendere dagli agenti della psitacosi che danno luogo a una polmonite atipica. Colpisce soprattutto persone in continuo contatto con pappagalli, tacchini ,piccioni. La diagnosi si fa con la fissazione del complemento in presenza di un antigene glicolipidico, un altra importante patologia è linfogranuloma venereo, l’infezione si ha sui genitali con lesioni superficiali di breve durata. Per poter raggiungere i linfonodi regionali portandoli a tumefazione. La diagnosi si basa sulla fissazione  e sulla cutireazioni di fray. Ultimo gli agenti del tracoma delle congiuntiviti che possono provocare infezioni epiteliali della congiuntiva una malattia molto diffusa in Africa settentrionale e nell ‘oriente e costituisce causa principale di cecità. Mentre la congiuntivite inclusi è una malattia del tutto benigna che guarisce spontaneamente. Per le diagnosi si utilizza la citologia

 

 

                                     Micoplasmi

 

I micoplasmi detti anche PPLO sono i più piccoli microrganismi capaci di vita autonoma in ambiente extra cellulare, non possegono parete cellulare sono ampiamente distribuiti in natura provocano nell’ uomo la polmonite atipica primaria mentre le maggior parte delle specie è saprofita. Hanno forme variabili per l’ assenza dell’ involucro rigido, la parete cellulare, si colora debolmente e sono in grado di attraversare i filtri con dimensioni inferiori 0.2-0.1 micron, hanno una membrana cellulare a 3 strati simile a quella degli animali. Hanno particolari esigenze nutritive, infatti necessitano di molecole a struttura steroidea per la crescita inoltre per il pnumoniae, agente della polmiìonite atipica, è indispensabile un fattore estratto dai lieviti. In agar sangue formano spesso zone di a-b emolisi intorno alle colonie. Facilita la loro identificazione sono resistenti alla penicillina e ai sulfamidici, mentre sono sensibili alle tetracicline ed alla Kanamicina. La polmonite riguarda soprattutto giovani e bambini, producendo focolai d’ infiammazione intestinali a carico del polmone con bronchite e bronchiolite, la diagnosi si basa sull’ isolamento del batterio nella faringe mediante terreni liquidi o solidi  contenenti siero, estratto di lievito, e penicillina. L’ accrescimento è molto lento ! settimana. La diagnosi sierologica si basa sulla dimostrazione su l’incremento di anticorpi diretto sull’ antigene superficiale del batterio.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                      Colorazioni in microbiologia

 

 

 

Colorazione Gram:

 

 

A) violetto                    1’-3’

 

B) lugol                        1’-3’

 

C) lavaggio

 

D) alcool etilico 95%     20’’

    o acetone                 5’’-10’’

 

E) lavaggio

 

F) fuxina                      1’

 

G) lavaggio

 

I gram + hanno un colore violetto i gram- hanno in colore rosso.

 

 

Metodo di Ziehl-Neecsens o alcool- acido resistenza

 

A) fuxina penilata

 

B) lavaggio

 

C) acido sulfidrico 20%: sino alla comparsa di

     una colorazione giallastra

 

D) lavaggio

 

F) alcool etilico 95%     30’’

 

G) blue di metilene             30’’

 

H) lavaggio

                             Alcool acido resistenti: rossi in campo blue.