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L'immunofissazione è basata su di un principio piuttosto semplice. Si tratta della fissazione in situ, mediante antisiero monospecifico, di una singola proteina contenuta nel tracciato elettroforetico.Dopo elettroforesi è possibile precipitare una singola individualità proteica mediante completa immersione della membrana in antisiero diluito; la reazione con il rispettivo antigene darà luogo alla formazione di uno stabile immunoprecipitato. |
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Introduzione:
Il procedimento qui descritto è senza dubbio quello più consono alle esigenze interpretative: si tratta della immunofissazione (IFE) che consiste nel precipitare, immediatamente dopo la separazione elettroforetica, una singola proteina per mezzo dell’antisiero monospecifico corrispondente. Le altre proteine, non fissate, vengono rimosse con lavaggi ed è pertanto possibile la comparazione diretta con il tracciato in esame. L’immunofissazione è una metodica prevalentemente
usata per identificare le componenti monoclonali (CM) presenti in un tracciato
elettroforetico.
Queste devono essere quantificate in precedenza densitometricamente in quanto il siero deve essere diluito sino a portare la concentrazione della CM nell’ambito dei 50/200 mg%. questo è infatti l’ambito di concentrazione consigliabile per ottenere una buona immunofissazione. Il riconoscimento della monoclonalità di una immunoglobulina elettroforeticamente omogenea si basa sulla dimostrazione che questa monta lo stesso tipo di catene leggere e pesanti. Pertanto l’identificazione della maggior parte delle CM è ottenibile con l’impiego dei cinque antisieri anti IgG, IgA, IgM, Kappa e Lambda. La metodica proposta da Diploid consente, grazie
all’impiego di antisieri monospecifici prediluiti, di eseguire il contatto
tra antigene ed anticorpo immergendo il supporto elettroforetico direttamente
nell’antisiero garantendone in completo contatto ed evitando di ricorrere
a scomode incubazioni in camera umida.
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Consigli pratici:
Il campione da utilizzare può essere siero o urina (specie per la ricerca della proteina di Bence Jones): nel caso in cui si utilizzi siero, si dovrà avere l’accortezza di prediluirlo con soluzione fisiologica, sino a portare la concentrazione della presunta C.M. entro il range di 50-200 mg%. La tecnica consente l’esecuzione in parallelo di quattro campioni utilizzando sei strisce di acetato di cellulosa. La prima striscia, su cui dovranno essere depositati i campioni interi, non dovrà essere sottoposta al trattamento con antisieri e soluzione ipertonica, ma direttamente colorata e decolorata dopo la migrazione fornirà i tracciati di repere. Le strisce, su cui andranno depositati i campioni prediluiti, dovranno essere contrassegnate ed immerse, al termine della migrazione, rispettivamente nelle apposite vaschette precedentemente preparate con gli antisieri anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-K ed anti- l. Dopo circa 15' di completa immersione sotto leggera agitazione periodica, gli antisieri contenuti nelle vaschette andranno recuperati, riversati nei rispettivi flaconi, e conservati (a4/8°C); senza spostare le strisce, si potrà a questo punto versare in ogni vaschetta un adeguato quantitativo di soluzione ipertonica, (circa 40ml), eseguire due lavaggi di circa 10-15' sotto agitazione, sostituendo ogni volta la soluzione; colorare, decolorare ed esaminare preferibilmente con l’ausilio di un transilluminatore. |
MATERIALI E STRUMENTI
1)-Camera umida per elettroforesi
2)-Applicatore semimicro per 4 campioni HT10M4 3)-Alimentatore per elettroforesi
4) Transilluminatore a luce opaca
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REAGENTI, CODICE, PREPARAZIONE: 1)-Tampone HR pH8,7 RV1111
2)-Dry Separation strips MT40S1
3)-Colorante Bleu Lisander RV11H3
4)-Soluzione decolorante RV16R6
5)-Kit Immunofissazione RT2000
6)-Reagenti ausiliari: soluzione
di lavaggio (sol. fisiologica)
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Esempi:
Campione con componente monoclonale
in zona Beta2, di tipo
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L'antisiero anti-IGG non ha evidenziato bande rapportabili per morfologia e posizione alla banda anomala evidenziata nel tracciato di repere. L'antisiero anti-IGA invece ha provocato la formazione di un precipitato nella identica posizione della banda segnalata. Nessuna reazione dello stesso tipo è stata osservata, in questo caso, nei tracciati trattati con antisieri anti-IGM ed anti-K, mentre l'antisiero anti-l ha provocato la stessa reazione dell'anti-IGA, oroginando un precipitato di forma simile e nella medesima posizione della banda osservata sul tracciato di repere. A causa delle evidenti differenze morfologiche tra i precipitati riferibili alle C.M. e quelli di origine policlonale, l'eventuale presenza di questi ultimi non interferisce con l'interpretazione, ma anzi può essere d'aiuto, a conferma della eventuale assenza di reazioni del tipo sospettato. Campione con componente monoclonale in zona Beta2, di tipo IGA Lambda e presenza di proteina di B.J. costituita da catene leggere libere di tipo Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 2500 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 2000 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 800 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 800 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1500 mg/dl. Sono presenti catene leggere libere di tipo Lambda nelle urine (proteina di B.J.) |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di oltre 2000 mg/dl. |
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl. |
IGM Kappa: la concentrazione della C.M. è di oltre 1000 mg/dl. |
IGM Kappa: la concentrazione della C.M. è di circa 1500 mg/dl. In questo caso è presente un precipitato in corrispondenza di tutti gli antisieri: non si tratta di una reazione immunochimica, ma di crioglobuline, rimaste sul punto del deposito. La reazione è avvenuta solo in corrispondenza degli antisieri anti-M e anti-K come si evidenzia dalla maggiore intensità di colorazione. |
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Ulteriori informazioni possono essere richieste presso: Diploid - Tel. 06-61.55.10.65 - 61.56.09.99 (Tel. /fax) - diploid@tiscali.it