L'identificazione fungina: metodi di studio

 

Prelievo e tecnica di semina

Il prelievo di porzioni di micelio dai substrati o dai terreni di coltura già seminati viene eseguito con "pennini" montati su un manico di metallo, abbastanza taglienti e facilmente sterilizzabili, oppure con l’ago da micologia, costituito da un filo di platino o di nichel-cromo di diametro di 1 mm, schiacciato, affilato a piagato all’estremità.

Per l’identificazione delle muffe non occorrono molte attrezzature ma importane è la qualità: cioè è necessario avere una buona memoria visiva, saper disegnare e poter fotografare; in tal modo si tende a costruire un manuale di identificazione dove conservare informazioni macroscopiche delle specie isolate dai diversi substrati.

La muffa, su di un substrato può presentarsi con un feltro più o meno colorato e con un odore caratteristico; quando il substrato in esame è visibilmente contaminato si può direttamente prelevare la muffa e precisamente se l’ammuffimento è uniforme si esegue un minimo prelievo e si appoggia sulla base di una piastra vuota per osservarlo allo stereoscopio; qualora l’ammuffimento risultasse disomogeneo si eseguono dei prelievi delle diverse parti e si seminano in una piastra di coltura con terreno.

La tecnica di semina consiste nell’eseguire 4 punti di inoculo per piastra; con tale tecnica definita di semina diretta si può giungere all’identificazione della specie e non a quantificare la carica fungina; inoltre permette di evidenziare solo le specie più competitive.

Con la tecnica di analisi per diluizione si riesce a separare le diverse specie e realizzare una precisa valutazione della contaminazione; si esegue prelevando 0,5-1 g di campione, si sospende in 50 ml di acqua sterile addizionata di qualche goccia di tween come agente bagnante che interviene nel distaccamento dei conidi, delle spore, dei frammenti di micelio, individuando così ogni forma riproduttiva del campione.

Dopo avvenuta omogeneizzazione nello Stomacher, si realizza una serie di diluizioni a partire dalla sospensione dei micogermi; con tecnica per inclusione si esegue l’inoculo di 1 ml di ogni diluizione in 20 ml di terreno fuso a 47 °C oppure si semina per spatolamento superficiale 0,1 ml della diluizione sul terreno già piastrato.

Lo scopo della tecnica delle diluizioni è di ottenere una sospensione ottimale tale per cui 1 ml contenga circa 50 micogermi.

 

Terreni nutritivi e temperature di incubazione

Per giungere al riconoscimento della specie fungina l’uso di un solo terreno è insufficiente; pertanto si allestiscono più semine nei seguenti terreni:

 

TERRENO

CARATTERISTICHE

Malto 2%

Povero che limita la crescita delle muffe più invasive e permette quella delle muffe più limitate

Malto 5%

Molto ricco addizionato del 5% di sale che assicura un’elevata pressione osmotica, condizione necessaria per lo sviluppo delle specie alofile

Czapek Dox agar

Contiene diversi sali inorganici e come unica fonte di azoto il sodio nitrato mentre come fonte di carbonio il saccarosio

Potato Dextrose agar

Adatto alla sporulazione dei miceti ed alla loro differenziazione, reso selettivo dal valore acido di pH (pH=3,5)

Sabouraud agar

Contiene peptone e caseina, reso selettivo dal pH acido di 5,6

Ossitetraciclina-Gentamicina-Glucosio Estratto di lievito agar

Addizionato di agenti antimicrobici come elementi selettivi

 

La temperatura di incubazione dopo la semina è di 20-25 °C; esistono comunque specie termotolleranti il cui ottimo di temperatura è di 35 °C.

Il periodo di incubazione va da 6 a 10 giorni.

 

Identificazione delle specie

Dopo avvenuto sviluppo colturale, se le colonie sono ben isolate si può procedere all’identificazione macroscopica con lo stereoscopio.

Qualora lo sviluppo si presentasse in modo uniforme ed ammassato bisogna eseguire un isolamento.

Per eseguire l’isolamento si tocca leggermente con la punta del pennino il centro della colonia e si inoculano 2-3 punti del nuovo terreno distribuito in piastra; oppure si preleva con il pennino una piccola porzione del bordo della colonia, compresa quella sottostante l’agar e si esegue il trapianto toccando il centro del nuovo terreno. Dopo incubazione si procede all’osservazione allo stereoscopio.

 

Visione allo stereoscopio

Allo stereoscopio si può vedere:

 

Caratteri colturali di un ceppo

Osservando uno sviluppo colturale fungino si ottengono informazioni riguardanti:

La tessitura è determinata dalla disposizione delle ife che supportano la riproduzione; può essere vellutata, lanosa, fascicolata.

Questi aspetti devono essere ben osservati e servono per orientarsi nella ricerca di caratteri specifici microscopici che si ottengono mediante l’allestimento di preparati microscopici di minime porzioni di micelio prelevato dalla colonia seminata.

 

Allestimento di un preparato

Con un pennino si preleva una piccola porzione del micelio e si aggiusta delicatamente su un vetrino portaoggetti, si copre il materiale con un coprioggetti evitando di fare bolle d’aria. Per poter meglio distendere ed osservare il micelio si usano dei liquidi di montaggio e successivamente dei coloranti.

I liquidi di montaggio più comuni sono l’acido lattico puro o diluito che serve per gonfiare le cellule ed il lattofenolo di Amann che incolore non modifica la naturale pigmentazione delle ife e dei conidi.

I coloranti usati in micologia sono: il Cotton blu al lattofenolo, il Blu trypan, la Lattofucsina.

 

Allestimento di microcolture

Per assicurarsi dei buoni preparati microscopici ottenuti dal prelievo delicato di minime quantità di campione, si preferisce eseguire una microcoltura del medesimo che si ottiene nel seguente modo:

  1. versare in una piastra una quantità di agar sterile fuso da formare uno strato di spessore di 1-1,5 mm
  2. quando il terreno si è solidificato, appoggiare la piastra su un foglio a quadretti con quadrati di lato di 1 cm e con un bisturi sterile incidere dei dadini di 1 cm di lato
  3. nel frattempo si sono sterilizzate delle piastre di vetro sul cui fondo è stato appoggiato un disco di carta bibula e sopra una bacchetta forgiata ad "U" su cui verranno appoggiati i vetrini portaoggetto anch’essi sterilizzati
  4. si asporta il dadino di agar e si appoggia al centro di un vetrino portaoggetti sistemato nella piastra sterile
  5. con un ago sterile si preleva un’aliquota di micelio e si inocula il dadino toccando al centro di ogni lato
  6. si copre l’inoculo con un vetrino coprioggetto sterile
  7. si versano alcuni ml di acqua distillata sterile sul disco di carta bibula ed alcune gocce di glicerina sterile per assicurare l’umidità della coltura nel tempo
  8. si chiude la piastra che funge così da camera di incubazione e si pone ad incubare alla temperatura idonea

 

Colorazione di un preparato di microcoltura

Il micelio che si è sviluppato con la tecnica della microcoltura rimarrà adesso al vetrino coprioggetto, per cui allontanando delicatamente questo dal dadino di agar, si asporteranno le ife ad esso adese.

Si fa asciugare bene il vetrino esponendolo ai vapori di formalina che uccidono la muffa e poi lo si appoggia su una goccia di colorante posto al centro di un vetrino portaoggetti.

Si fa bene aderire e si procede all’osservazione microscopica.

Un’altra tecnica per preparare il vetrino è quella dello scotch che prevede l’impiego di una piccola parte di scotch fatto aderire dapprima sul micelio e poi su un vetrino portaoggetti.

 

Caratteri microscopici di un ceppo

L’osservazione microscopica è la parte finale di un’indagine fungina; i caratteri da osservare al microscopio sono:

L’osservazione di tutti gli aspetti (macroscopici e microscopici) appartenenti al fungo in esame, ordinati secondo uno schema riepilogativo, permetterà di giungere all’identificazione della specie mediante la consultazione di tabelle riassuntive degli aspetti tipici di ogni specie.

 

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