Il sequencing del DNA consiste nell'esatta determinazione della sequenza di nucleotidi di una data genomica, quindi di un intero gene e infine di un intero cromosoma. Il primo acido nucleico ad essere sequenziato fu il tRNA, la cui molecola è relativamente corta, contenendo tra i 75 e gli 80 nucleotidi: la catena oligonucleotidica veniva spezzata, utilizzando degli enzimi specifici che rompevano i legami diestere-fosforici, in segmenti sempre più corti sino a quando questi potevano sequenziati con semplici procedure ( stepwise degradation). Le endonucleasi di restrizione, enzimi che spezzano le catene di oligonucleotidi in siti specifici, furono scoperte a partire dal 1970, grazie agli studi condotti sui batteri: questi enzimi sono in grado di identificare specifiche sequenze, da 4 a 8 coppie di basi ( bp). Un dato sito contraddistinto da 4 bp si ripete, in media, ogni 256 bp, e un sito da 6 bp, ogni 4096 bp. La distribuzione dei siti nel DNA è tuttavia irregolare, cosicché una regione può essere tagliata più o meno frequentemente rispetto alla media statistica. Oggi il sequenziamento del DNA può essere effettuato seguendo due strategie:

• Nel metodo enzimatico (Sanger) quattro separate reazioni effettuate sul segmento di DNA da analizzare, producono ciascuna frammenti etichettati di DNA, terminanti nelle basi Adenosina, Citosina, Guanina e Timidina.
• Nel metodo chimico (Maxam, Gilbert) vengono prodotti frammenti terminanti in G, G+A, C+T, o C tipicamente.

In entrambi i casi i quattro set dei prodotti di reazione sono sottoposti a elettroforesi in corsie adiacenti su un gel di poliacrilamide ad alta risoluzione. L'analisi di bande formate nel gel dalle etichette, permette di risalire alla lunghezza dei frammenti di DNA, generati in ognuna delle quattro reazioni. Da queste informazioni è possibile ricavare direttamente la sequenza delle basi del DNA.