VETTORI MOLECOLARI: Plasmidi, Batteriofagi, Cosmidi

I vettori molecolari sono delle sequenze di DNA di diversa natura, che possono replicarsi autonomamente e nei quali sia possibile inserire delle altre sequenze nucleotidiche. Devono essere di piccole dimensioni, facilmente purificabili in ampia quantità e devono codificare per una proprietà che può essere usata per selezionare i batteri che hanno ricevuto il DNA da clonare. Nè la proprietà selettiva nè le funzioni di replicazione dei vettori devono essere inattivate quando il DNA estraneo viene inserito, il vettore deve avere siti unici di attacco per diversi specifici enzimi di restrizione, deve avere proprietà che permettono di selezionare molecole di DNA ricombinante ed essere in grado di promuovere l'espressione delle molecole clonate. I vettori con questi requisiti sono stati costruiti dai plasmidi e dai fagi che si trovano in natura.

Plasmidi

(Del giudice 1987; Ayala e Kiger 1984; Maniatis et al. 1982 pg 3-15)

I plasmidi sono sequenze di DNA extracromosomiche che hanno la capacità di replicarsi autonomamente ed alcuni di passare da una cellula all'altra e diventare parte integrante del cromosoma ospite. I plasmidi portano con sè dei geni in grado di conferire particolarità fenotipiche ai batteri che li contengono, come la resistenza agli antibiotici. Il plasmide pBR 322 è quello più ampiamente usato per clonare, è di piccole dimensioni, porta i geni per la resistenza agli antibiotici ampicillina (amp) e tetraciclina (tet). Contiene un singolo sito di restrizione per PstI all'interno del gene amp e singoli siti di restrizione per BamHI e SalI  all'interno del gene tet. L'inserimento di un gene nei siti sopra citati determina La perdita della resistenza nei confronti di detti antibiotici permettendo, attraverso il piastramento in replica, la selezione dei cloni che hanno ricevuto il nuovo gene.

Batteriofagi

(Maniatis et al., 1982, pg 22-23, pg 53)

I batteriofagi sono dei virus che infettano i batteri. Alcuni di essi (Lambda ed M13) sono stati adattati alle esigenze dei biologi molecolari che hanno modificato opportunamente il loro cromosoma per dotarlo di specifici siti di restrizione ed hanno eliminato quella parte del genoma non indispensabile per la replicazione.

Cosmidi

(Del giudice, 1987; Maniatis et al., 1982 pg 47)

I cosmidi sono dei vettori ibridi fra un plasmide, che fornisce la resistenza agli antibiotici e una regione del DNA di un batteriofago detta "cos" che conferisce loro particolari caratteristiche.

ENZIMI USATI IN INGEGNERIA GENETICA

Gli enzimi sono strutture proteiche dotate di caratteristiche e qualità che li rendono indicati per la realizzazione di tutte quelle funzioni biosintetiche e fisiologiche necessarie e indispensabili per il mantenimento della vita. Se in una soluzione vi sono 1.000 composti diversi l'enzima agisce solo su uno o su pochi altri che hanno le caratteristiche strutturali necessarie per legarsi al sito catalitico in termine di dimensione, forma, numero, tipo di gruppi chimici e loro disposizione spaziale Le endonucleasi (enzimi di restrizione) sono enzimi il cui compito è quello di riconoscere e tagliare il DNA estraneo che può avere infettato la cellula batterica. Questa caratteristica è stata usata dai biologi molecolari per tagliare una molecola di DNA di un organismo in particolari siti detti "di restrizione". Sulla base dei tagli effettuati vengono distinte tre classi di endonucleasi e per le loro caratteristiche le ENDONUCLEASI DEL II TIPO sono considerate i migliori strumenti per la tecnologia del DNA ricombinante.

Fasi per la produzione di un organismo transgenico

·         Il DNA donatore viene sottoposto ad enzimi di restrizione che lo tagliano in frammenti.

·         Gli stessi enzimi vengono poi usati per creare sul vettore dei punti di rottura complementari in cui poter inserire il DNA da clonare.

·         Mediante l'azione di altri enzimi (Ligasi) si saldano i frammenti del DNA del donatore che interessano (geni per determinate proteine) ai vettori.

·         Il DNA ricombinante a questo punto è pronto per essere introdotto nelle cellule.

·         Il trasferimento delle molecole di DNA ricombinante può avvenire mediante trasformazione o trasduzione, processi che avvengono anche in natura, o con nuove tecniche come l'elettroporazione e il trasferimento meccanico di particelle.

·         Fermo restando la compatibilità del vettore con l'organismo in cui è stato inserito, si otterrà la sua replicazione e quella del gene isolato in più copie (clonazione) contestualmente al processo di divisione cellulare.

Note

[1] Il DNA (AcidoDeossiriboNucleico) è una macromolecola costituita da due filamenti le cui unità fondamentali, dette nucleotidi, sono identificate con le lettere A (Adenina), T (Timina), C (Citosina), G (Guanina). A, T, C, G costituiscono un alfabeto di quattro lettere che portano l'informazione solo se sono disposte in sequenze precise così come le lettere dell'alfabeto possono recare l'informazione solo se organizzate in parole e frasi con significato.

[2] Il clone è un insieme di cellule o di organismi geneticamente identici, derivati da un unico genitore e dotati dello stesso patrimonio genetico.

[3] I mitocondri sono organuli cellulari che contengono un DNA distinto da quello contenuto nel nucleo cellulare i cui geni specificano proteine per le funzioni mitocondriali.

[4] I nucleotidi sono le subunità che costituiscono il DNA.

[5] Il DNA dei batteri è organizzato in una struttura detta cromosoma.

[6] Il fenotipo di un organismo è ciò che osserviamo di esso, designa le caratteristiche di un individuo in un dato momento della sua storia e in quel determinato ambiente.

[7] Un sito di restrizione è il luogo fisico in cui agisce un enzima di restrizione provocando un taglio del DNA.

[8] BamHI, SalI e PstI sono enzimi di restrizione.

[9] Metodica che consente di isolare i ceppi batterici che hanno subito la trasformazione.

[10] Il sito catalitico è quella parte dell'enzima in cui avviene la reazione chimica.