La ricerca sulla SMA presso OSU
dott. Arthur Burghes, Ohio State University

Nella nostra ricerca del trattamento per la SMA si sono avuti notevoli progressi. Negli ultimi anni è stato creato un modello animale per l'atrofia muscolare spinale (SMA). Questo modello ci permette di rispondere a domande critiche per lo sviluppo di un approccio terapeutico. La prima domanda è: Dove e quando i livelli di SMN vanno ristabiliti? La seconda è: Quali fattori - oltre al gene SMN2 - concorrono a regolare la severità della malattia? L'identificazione di questi geni ci darà nuovi obiettivi per lo sviluppo della terapia.

Il mio gruppo di studio ed altri abbiamo sviluppato altresì le tecniche di screening ad ampio spettro (HTS) per identificare dei composti in grado di incrementare l'espressione del gene SMN2 (presente in tutti i pazienti SMA), siccome è ormai nota la sua capacità di modificare la severità della malattia. Le sperimentazioni HTS ricadono in due categorie. La prima è quella nella quale noi collaboriamo con Aurora Biosciences, provvedendo alla fornitura dei reagenti di base e del programma di sperimentazione che viene poi realizzato da loro. La seconda categoria è quella nella quale sviluppiamo e realizziamo la sperimentazione in proprio, come dettagliato più in basso nella sezione High Throughput Screening.

Dove e quando è necessaria la proteina SMN?

La SMA è causata da bassi livelli di proteina SMN nei motoneuroni del midollo spinale. Tuttavia il basso livello proteico che causa la degenerazione dei motoneuroni è presente nel corpo cellulare degli stessi oppure nel muscolo? (In altre parole, dove è necessaria la proteina SMN?) L'opinione generale è che il livello di SMN sia critico nei motoneuroni, ma non vi sono dati sperimentali che indichino chiaramente che il tessuto in oggetto sia il motoneurone, il muscolo oppure entrambi. E' molto importante per lo sviluppo di un approccio terapeutico conoscere la risposta a questa domanda!

Ad esempio, un farmaco che attivi l'espressione dell'SMN2 dovrebbe funzionare a livello del tessuto giusto, e se questo è il muscolo allora è importante provvedere a un approccio che corregga il difetto muscolare, come il trapianto di cellule staminali. Per focalizzare la nostra attenzione su questa questione abbiamo sviluppato topi con alti livelli di SMN nei muscoli oppure nei motoneuroni. Questo è stato fatto grazie a tecniche genetiche che hanno indotto una maggiore espressione di SMN nei tessuti muscolari o nervosi.

Questi topi sono stati quindi incrociati per ottenere infine topi SMA con bassi livelli di SMN in tutti i tessuti tranne che nei muscoli o nei motoneuroni. Attualmente stiamo creando e analizzando questi topi; in particolare cerchiamo la sopravvivenza oltre il sesto giorno di vita. Se l'espressione della SMN nei motoneuroni (ma non nei muscoli) correggesse o alterasse il fenotipo SMA allora questo indicherebbe che le cellule critiche sono i motoneuroni. Correzioni nei muscoli indicherebbero che questo è il tessuto critico. Questa sperimentazione può anche mirare alla questione dell'importanza della SMN ad alti livelli in tutti i tessuti, dal momento che la SMN non sarà corretta dappertutto. Il fatto di conoscere quali tessuti necessitino di correzione potrebbe essere considerato un fatto puramente accademico, ma non lo è! Tale identificazione può cambiare l'approccio terapeutico, particolarmente per quanto riguarda la terapia con cellule staminali e la terapia genica.

La seconda questione di importanza critica per gli approcci terapeutici alla SMA è:- Quando sono necessari alti livelli di SMN per la correzione del fenotipo? Ristabilendo precocemente i livelli di SMN dovremmo ottenere la correzione della malattia, ma se il processo patologico è già in atto? Per rispondere a questa domanda abbiamo creato delle linee di topi nei quali l'espressione della SMN è inducibile attraverso la somministrazione agli animali di un antibiotico. A causa della natura di questi topi e alla difficoltà di ottenimento di topi con alta espressione proteica, abbiamo creato un gran numero di linee genetiche in modo da essere sicuri di poter effettuare questi esperimenti. Sinora siamo riusciti a controllare l'espressione della SMN attraverso un "promoter" e un antibiotico repressore. Attualmente stiamo determinando in che misura l'espressione della SMN possa essere controllata dall'antibiotico.

Questi topi sono poi incrociati con il topo SMA permettendo di "accendere" e "spegnere" la SMN in fasi precise dello sviluppo e quindi di determinare quando siano necessari alti livelli proteici. Questi animali possono essere utilizzati anche per determinare che cosa avviene se riduciamo drasticamente il livello di SMN su soggetti ad alto livello proteico. Ne può risultare un danno ai motoneuroni? E se è così, dove inizia tale danno? Tutto ciò sarà cruciale per la determinazione di quando e con quali effetti reintrodurre la SMN.

Attenuazione del fenotipo SMA nei topi

I topi SMA che abbiamo creato presentano un fenotipo relativamente severo (equivalente alla SMA tipo I). Tuttavia, sarebbe molto vantaggioso avere anche a disposizione topi con un più attenuato fenotipo, cosa che faciliterebbe il test dei farmaci. Abbiamo affrontato il problema in due modi. In primo luogo, abbiamo generato topi transgenici portatori di una mutazione riscontrata su pazienti con forme leggere di SMA. Questa mutazione, chiamata A2G, si osserva infatti su pazienti aventi una sola copia del gene SMN2. Questi topi sono stati poi accoppiati con topi SMA e la prole viene ora analizzata per valutare la modificazione della severità della malattia.

Il secondo approccio si occupa dei cosiddetti modificatori fenotipici (sostanzialmente fattori genetici che rendono la malattia meno severa). Si è recentemente stabilito che il numero di copie del gene SMN2 è un fattore determinante della severità, ma non è l'unico fattore. Su pazienti, noi e altri gruppi abbiamo riscontrato congiunti aventi un identico numero di copie del SMN2 con una severità fenotipica totalmente diversa.
La spiegazione più semplice di queste osservazioni è che ci sono dei geni che si trovano in altre parti del genoma e hanno forme differenti, i quali influenzano la severità del fenotipo. L'identificazione di questi geni è importante per due ragioni. La prima è che forniscono obiettivi differenti da usarsi nello sviluppo di farmaci. La seconda è che potrebbero farci comprendere il meccanismo per cui il livello di SMN influisce sui motoneuroni. E' estremamente difficile mappare il locus di questi modificatori nel genoma umano, ma nei topi è considerevolmente più facile.
Occorre innanzi tutto dimostrare che il fenotipo animale possa essere modificato da differenti background genetici. Abbiamo così incrociato i topi SMA con topi aventi diversi background genetici e ora stiamo analizzando gli effetti sulla severità della SMA. Una volta identificati questi topi, essi potranno essere usati per mappare i geni modificatori.

High Throughput Screening

Noi ed altri abbiamo iniziato la sperimentazione di farmaci attraverso vari sistemi: il laboratorio del dott. Androphy alla Tufts University ha sviluppato un elegante sistema per monitorare i livelli prodotti di SMN, attraverso il conteggio del numero di particelle nucleari della SMN chiamate "gemme". In cellule ricavate da pazienti con SMA tipo I il numero di tali particelle è fortemente ridotto. Abbiamo prodotto linee genetiche di cellule con basso livello di gemme, adatte all'uso negli screening ad ampio spettro. Attualmente stiamo cercando di sviluppare linee analoghe di motoneuroni. Il conteggio delle gemme è realizzato usando l'array scan II, capace di effettuarlo automaticamente. Quindi le cellule vengono trattate con il composto, marcate e analizzate con l'array scan II.

Usando queste tecniche abbiamo iniziato lo screening di librerie di composti chimici. Abbiamo identificato dei composti che sembra incrementino la quantità di SMN mRNA. Questi sono detti "primary hits" (risultati primari) e necessitano di essere caratterizzati maggiormente per confermarne l'azione, ma per lo meno sono incoraggianti. Per convalidarne l'attività, devono essere testati in sperimentazioni secondarie.

Deve essere chiaro che questi primi risultati sono un precocissimo stadio dello screening; essi dicono solamente che abbiamo un composto attivo. Ciò deve essere confermato quindi da una sperimentazione secondaria e perfino dopo tale conferma non è detto che avremo un composto utile per il trattamento di pazienti o animali. A questo punto diventeranno critici i dati sulla tossicità e sulla disponibilità del farmaco nel tessuto corretto.
E' estremanente importante disporre di molti "primary hits" in modo da massimizzare la probabilità che uno di essi sia impiegabile. Per il momento non è questo il caso, avendo noi soltanto dei risultati ancora da confermare e che probabilmente prima serviranno a scoprire la strada per arrivare alla modifica dell'espressione della SMN2. Ci sono ancora molti esperimenti da fare e dobbiamo essere molto accurati per assicurarci l'identificazione del composto necessario.

Vorrei segnalare che quella sopra riportata è la ricerca che si sta svolgendo a OSU, finanziata da numerosi soggetti come il National Institute of Health (NIH), Families of SMA, e Matthew, Preston and Madison. Inoltre non lavoriamo da soli; abbiamo molte collaborazioni con altri gruppi di ricerca impegnati nel campo della SMA e si sta lavorando molto presso altri laboratori per identificare sia i meccanismi della SMA che i composti chimici capaci di alterarne la patogenesi. Tale ricerca sta entrando in una fase molto interessante ma non siamo ancora al traguardo e restano molte cose da fare. Non sappiamo quanto lontano dovremo andare nè quanto tempo ci vorrà; ci sono segnali incoraggianti ma non conosciamo quando o da dove arriverà la svolta. Tutti speriamo che arrivi presto, ma sappiamo che richiederà un accurato lavoro di conferma di ogni nostro passo.