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Nel 1849 a causa della insostenibile situazione del Bonifazio (l'Ospedale fiorentino del Bonifazio), il Governo granducale decise di trasferire l'istituto all'Ambrogiana.  L'anno dopo (1850) fu affidato all'architetto Giuseppe Cappellini il progetto di trasformazione della villa in manicomio. Ma nel giugno del 1853 il progetto di Spedale dei Dementi Acuti che prevedeva uno stravolgimento della villa con l'aggiunta di uno spropositato corpo edilizio con velleità di Panopticon fu bocciato. Così, fu dato incarico all'architetto Mazzei di un progetto di riduzione a carcere ...  in tre mesi il progetto era concluso ed in sei mesi duecento detenuti, provenienti dalle Murate erano sistemati nelle sezioni-scudereie.Con la Restaurazione (1849) fu ridotta a Stabilimento Penitenziario del granducato. La mattina del 16 agosto 1854 fu aperto lo Stabilimento provvisorio dell'Ambrogiana. Nel 1856 dopo ultimati tutti i lavori di riduzione ... fu convertita a Stabilimento Penitenziario Correzionale Femminile ove scontavansi tutte le specie di pene contemplate dal Codice toscano. Poco tempo dopo fu adibito a Carcere limitatamente però ai due piani superiori, il vasto e grandioso edifizio fatto costruire da Pietro Leopoldo in prossimità della villa per uso di scuderie e rimesse, alle quali non fu fatta alcuna innovazione. Dal 1859 al 1861 fu costruita una Sezione di 52 celle (26 per piano) fu allora limitato il carcere per le donne al palazzo principale o Villa ed alla accennata nuova Sezione, mentre destinavansi a Carcere maschile il fabbricato delle antiche scuderie. Sul finire del 1868 furono trasferiti altrove i condannati adulti e la Sezione maschile servì per ricovero dei minorenni. In ultimo, nel 1875 soppressa la Sezione Femminile fu convertita a Casa di Custodia fino al mese di maggio del 1868 essendosi nel successivo giugno aperto il nuovo Manicomio Criminale. Così, nel giugno del 1886 fu aperto il nuovo Manicomio Criminale dell'Ambrogiana - primo Manicomio del Regno d'Italia (1861) - presso Montelupo Fiorentino. Mentre, il progetto di convertire l'antica Villa Medicea in Manicomio criminale, ad opera dell'ingegnere Bulgarini, risale al 1884. Nondimeno, a fronte di una data certa (1886) la critica fa risalire al 1854 o 1888 l'adattamento a Manicomio Criminale. Agli inizi del Novecento (1914) con il progetto per la costruzione di un muro di cinta sotto la 3° sezione del detto Manicomio e lungo la via alzaia dell'Arno si compirà l'ennesimo e, ultimo, atto di riduzione del complesso architettonico dell'Ambrogiana. Negli anni dell'emergenza - gli anni di piombo -si metteranno in atto nuovi provvedimenti di carattere cautelare, nonostante le proposte di legge di assistenza ospedaliera psichiatrico.